Meng Zhang, Yuan Yuan, Qing Wang, Xiaobo Li, Jiuzhang Men, Mingxin Lin; Китайската медицина Chai Hu Li Zhong Tang предпазва от безалкохолни мастни чернодробни заболявания, като активира AMPKα. Biosci Rep 21 декември 2018 г .; 38 (6): BSR20180644. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20180644

chai

Изтеглете файла с цитат:

Въведение

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е клиничен синдром, характеризиращ се с хепатоцелуларна стеатоза, клетъчно увреждане и инфилтрация на възпалителни клетки в чернодробните тъкани на индивиди без анамнеза за прекомерно пиене [1,2]. Епидемиологичните проучвания показват, че разпространението на NAFLD е надминало разпространението на вирусен хепатит и алкохолно чернодробно заболяване (ALD), което го прави най-често диагностицираният медицински и социален проблем [3]. В западните страни разпространението на NAFLD сега е два до три пъти по-високо от това на хепатит В, хепатит С и ALD. В Япония разпространението на NAFLD се е увеличило 3–20 пъти и сега надхвърля това на хепатит С. Ранната клинична проява на NAFLD е предимно прост мастен черен дроб, който се характеризира с чернодробна стеатоза и натрупване на триглицериди (TG) в чернодробна тъкан [4,5].

Въпреки че патогенезата на NAFLD остава неясна, много фактори могат да доведат до нейното появяване и развитие [6,7], включително нарушения на липидния метаболизъм, инсулинова резистентност, свободни кислородни радикали, претоварване с желязо и възпаление [8,9]. Прекомерното усвояване на хранителни вещества от чернодробната тъкан е основната причина за чернодробна стеатоза. Въпреки че черният дроб може да съхранява малко енергия, получена от хранителни вещества, прекомерното количество хранителни вещества непокътнато ускорява производството на мастни киселини и TG, които се натрупват в чернодробните тъкани [6,10]. След това оксидативният стрес, липидната пероксидация и възпалителните цитокини помагат да се медиира чернодробната некроза, възпалението и фиброзата [4].

Аденилат-активираната протеинкиназа (AMPK) е важен фактор, който регулира вътреклетъчния енергиен метаболизъм [11]. Той може да регулира енергийния метаболизъм на тялото, като усеща промени в съотношението на AMP към ATP в цитоплазмата и след това помага да се поддържа адекватно енергийно снабдяване в сравнение с баланса на търсенето [12,13]. Когато AMPK сигналните молекули се активират, различни пътища, участващи в метаболизма на мастните киселини и TG, се изключват и метаболитните пътища, участващи в окисляването на мастните киселини, усвояването на глюкозата и гликолизата се активират [14,15].

Предишни проучвания потвърдиха, че сигналните молекули AMPK играят ключова роля в метаболизма на черния дроб в липидите [12]. Има два AMPK целеви протеина: ацетил коензим А карбоксилаза (ACC) и 3-хидроксил-3-метилглутарил-коензим А редуктаза (HMGR), съответно. ACC и HMGR играят важна роля в синтеза на мастни киселини и холестерол (TC) [16]. Фосфорилирането на AMPK инхибира АСС активността и намалява нивата на малонил-КоА в чернодробните клетки, като по този начин инхибира синтеза на мастни киселини и засилва тяхното използване и окисление. Тези ефекти в крайна сметка служат за инхибиране на синтеза на ТС и мастни киселини в черния дроб [17]. Много проучвания потвърждават, че PPAR-γ и SREBPs, като SREBP2, играят важна роля за поддържане на липидната хомеостаза при животните [18].

Традиционната китайска билкова медицина Chai Hu Li Zhong Tang (CHLZT) се състои от Xiao Chai Hu Tang и Li Zhong Tang. Проучванията показват, че Сяо Чай Ху Танг е ефективен за намаляване на телесните мазнини и теглото [19–21]; обаче неговата полезност и механизмът на действие при лечение на NAFLD остават неясни. В настоящото проучване установихме модел на плъхове на NAFLD чрез хранене на плъхове с високо съдържание на мазнини. Ние също така установихме клетъчен модел на NAFLD чрез култивиране на HepG2 клетки в среда с високо съдържание на мазнини. След това използвахме тези модели, за да проучим дали CHLZT може да бъде полезен за лечение на NAFLD, както и неговите ефекти върху сигнализирането на AMPK, PPAR-γ и SREBP2.

Материали и методи

Стандартизиран препарат на CHLZT

Изходните лекарствени материали Bupleurum (6 g), Scutellaria (6 g), джинджифил Pinellia (9 g), Codonopsis (9 g), Atractylodes (12 g), Poria (15 g), куркума (6 g), Zhigancao (6 g), джинджифил (9 g) и хинап (9 g) са идентифицирани от професионален персонал в Медицинския институт и след това са проверени за техния специфичен щам, произход и качество. Тези местни лекарства не съдържат тежки метали. Билките се почистват старателно два пъти в петкратни обеми чешмяна вода и след това се накисват за 30 минути в десеткратен обем дестилирана вода. След това се готвят в продължение на 1 час със 700 вата топлина; след което водата се отстранява чрез филтруване. След това остатъкът се готви втори път при същата температура в продължение на 40 минути; след което се добавя шесткратен обем вода и остатъкът се вари отново в продължение на 40 минути. След това филтратите се комбинират и концентрират чрез нагряване със 700 вата топлина; това произвежда течност, която съдържа 1 g суровини на ml. Течността беше опакована стерилно и подготвена за употреба.

Изследвания върху животни

Здрави SPF мъжки SD плъхове бяха получени от Експерименталния център за животни на Южния медицински университет и разпределени в четири групи: нормална група, NAFLD група, CHLZT група за лечение и AMPK агонист AICAR група за лечение (n = 10 плъхове на група). За да се установи NAFLD модел на плъхове, плъховете са хранени с диета с високо съдържание на мазнини (88% обикновена храна + 2% TC + 10% свинска мас) в продължение на 8 седмици след адаптивно хранене в продължение на 1 седмица. Плъховете от нормалната група били хранени с нормална диета. Плъховете в групата на CHLZT получават ежедневно интрагастрален CHLZT (3,5 ml/ден) и са хранени с високо съдържание на мазнини от 9-та до 12-та седмица на проучването. Плъховете в групата за лечение с AICAR получават ежедневна интраперитонеална инжекция с AICAR (25 mg/kg/ден), която първоначално се приготвя в DMSO и след това се разрежда допълнително със стерилен физиологичен разтвор до желаната концентрация. Тези плъхове също са били хранени с високомаслена диета [22,23]. След 12 седмици всички плъхове бяха убити чрез дислокация на шийката на матката и бяха събрани кръвта и чернодробните им тъкани. Протоколът за проучването е одобрен от институционалния комитет по грижа и употреба на животните към университета по китайска медицина в Шанси.

Серумни нива на TC, TG, липопротеин-холестерол с ниска плътност, липопротеин-холестерол с висока плътност, аланин аминотрансфераза и аспартат аминотрансфераза

След 8 седмици непрекъснато лечение, плъховете се гладуват в продължение на 12 часа, след което се събира кръв от коремната аорта на всеки плъх и серумът се отделя за анализ. Серумни нива на TC, TG, липопротеин-холестерол с ниска плътност (LDL-C), липопротеин-холестерол с висока плътност (HDL-C), нива на аланин аминотрансфераза (ALT) и аспартат аминотрансфераза (AST) при пет произволно избрани плъхове от всяка група (други за ELISA) бяха открити с автоматичен биохимичен анализатор.

Клетъчна култура и лечение

HepG2 клетки (ATCC, Manassas, VA, USA) бяха култивирани в 79% модифицирана от Dulbecco среда на Eagle (DMEM, 10569044, Gibco, Waltham, MA, USA), която съдържаше 20% FBS (10099-141, Gibco) и 1% пеницилин- стрептомицин (100 U/ml, 15140-122, Gibco) [24]. Други групи HepG2 клетки се култивират в среда, която съдържа 1% маслена емулсия с дълга верига (0338-0519-48, Intralipid® 20%, Baxter, Deerfield, IL, САЩ) за 48 часа; тези клетки бяха използвани за конструиране на NAFLD клетъчен модел [25]. След това клетките бяха третирани или със CHLZT-съдържащ серум (дефиниран като Съединение-S) или със AICAR-съдържащ серум (дефиниран като AICAR-S) при крайни концентрации от 20%. Контролните клетки бяха инкубирани с нормален FBS (20%).

Маслено червено O оцветяване

Парчетата чернодробна тъкан се отделят и се съхраняват в течен азот при -80 ° C. Секции от тъкан и аликвотни части от HepG2 клетки се промиват три пъти с PBS и след това се фиксират с 10% формалдехид за 1 h при стайна температура. След това тъканните секции и клетки бяха инкубирани с масло Red Red за 30 минути, изплакнати три пъти с дестилирана вода и след това наблюдавани под обърнат микроскоп. Използва се софтуер ImagePro Plus 7 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, САЩ), за да се определи количеството на оцветяването с Oil Red O.

Имунохистохимия

ELISA

След лечение нивата на HMGR и инсулин бяха изследвани с помощта на комплекти ELISA (Elabscience, Houston, TX, U.S.A.) съгласно инструкциите на производителя. След инкубиране с биотинилирано антитяло (100 μl/гнездо) в продължение на 1 h при 37 ° C, плочките с култура се измиват пет пъти с PBS, инкубират се със съответния ензимен субстрат при 37 ° C в продължение на 30 минути и след това се инкубират на тъмно с хромогенен субстрат (3,3 ′, 5,5′-тетраметилбензидин (TMB)) разтвор за 15 минути. Реакциите на оцветяване се прекратяват със 100 μl STOP разтвор. Оптичната плътност на всяка ямка при 450 nm се отчита с четец на микроплаки.

qRT-PCR

След лечението, общата РНК в макрофагите, получени от костен мозък (BMM), беше изолирана, използвайки реагент TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), съгласно стандартен протокол. RT-qPCR беше извършен с помощта на SYBR Premix Ex Taq ™ (Takara, Shiga, Япония) и PCR система в реално време (Applied Biosystems, Санта Клара, Калифорния, САЩ), съгласно инструкциите на производителя. Използваните праймери са показани в Таблица 1. Всички тестове са проведени в три екземпляра. Експресията на гена се нормализира до експресия на GAPDH и се изчислява, използвайки метода 2 -ΔΔC t.

Ген. Препращаща последователност (3′ – 5 ′). Обратна последователност (3′ – 5 ′) .
Плъх-PPARγ TACCACGGTTGATTTCTCCA TGAGGGAGTTTGAAGGCTCT
Плъх-SREBP-2 GGGACATCGACGAGATGCTA AATGGGACCTGGCTGAATGA
Плъх-GAPDH CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT GGGTAGAGTCATACTGGAACATG
Човек-PPARγ ACCAAAGTGCAATCAAAGTGGA ATGAGGGAGTTGGAAGGCTCT
Човек-SREBP-2 CCTGGGAGACATCGACGAGAT TGAATGACCGTTGCACTGAAG
Човек-GAPDH TGTTCGTCATGGGTGTGAAC ATGGCATGGACTGTGGTCAT
Ген. Препращаща последователност (3′ – 5 ′). Обратна последователност (3′ – 5 ′) .
Плъх-PPARγ TACCACGGTTGATTTCTCCA TGAGGGAGTTTGAAGGCTCT
Плъх-SREBP-2 GGGACATCGACGAGATGCTA AATGGGACCTGGCTGAATGA
Плъх-GAPDH CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT GGGTAGAGTCATACTGGAACATG
Човек-PPARγ ACCAAAGTGCAATCAAAGTGGA ATGAGGGAGTTGGAAGGCTCT
Човек-SREBP-2 CCTGGGAGACATCGACGAGAT TGAATGACCGTTGCACTGAAG
Човек-GAPDH TGTTCGTCATGGGTGTGAAC ATGGCATGGACTGTGGTCAT

Уестърн блот изследвания

Общите протеини на чернодробните тъкани (четири плъха, избрани на случаен принцип от всяка група) и клетките се екстрахират от BMMs, използвайки RIPA лизисен буфер и след това се определят количествено с Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, U.S.A.). Протеините се разделят с 10% SDS/PAGE и след това се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана, която след това се блокира с 5% обезмаслено мляко. След това мембраната се инкубира с първични антитела, които включват анти-AMPK, анти-p-AMPK, анти-ACC, анти-p-ACC, анти-PPARγ и анти-SREPBP-2 (Abcam, САЩ) за една нощ при 4 ° C и след това се инкубира с конюгирано с HRP вторично антитяло (Bioworld, Китай) за 1 h при стайна температура. Имунооцветените протеини се визуализират с ECL-Plus реагент (Millipore, Billerica, МА, САЩ).

Статистически анализ

Нивата на инсулин в моделната и CHLZT групите са значително по-високи от тези в контролната група (Фигура 1G). Лечението с CHLZT или AICAR значително намалява нивата на инсулин в сравнение с нивата на инсулин в моделната група (Фигура 1G). В обобщение, лечението с CHLZT или AICAR намалява серумните нива на TG, TC, LDL-C, AST, ALT и инсулин при плъхове NAFLD и значително увеличава техните серумни нива на HDL-C, което предполага, че CHLZT и AICAR могат да служат за защита NAFLD плъхове.

Съдържанието на мазнини в черния дроб на плъховете NAFLD намаля след лечение с CHLZT

Разпределението на мазнини в проби от черен дроб на плъх се наблюдава след оцветяване с масло Red Red O (Фигура 2А). Липидните капчици в чернодробните тъкани бяха оцветени в червено и разпределени в клетъчната цитоплазма. Чернодробните секции на контролните плъхове съдържаха значително по-малко капчици мазнини, отколкото чернодробните части на моделни плъхове. Лечението с CHLZT или AICAR значително намалява броя на липидните капчици при плъховете с модел NAFLD.

Имунохистохимично оцветяване на мастни вещества и p-AMPKα в чернодробните тъкани

CHLZT индуцирано фосфорилиране на AMPKa при NAFLD плъхове

Имунохистохимично (IHC) оцветяване за p-AMPKα беше проведено, за да се изследва ролята на AMPKα в лекувани с CHLZT плъхове NAFLD (Фигура 2В). Образци от чернодробна тъкан, които са положителни за p-AMPKα, показват кафяв цвят в цялата цитоплазма. В сравнение с оцветяването с p-AMPKα в контролните проби, количеството на оцветяването с p-AMPKα в образци от групата на моделите е значително намалено. Това показва, че лечението с CHLZT и AICAR значително е увеличило количеството на p-AMPKα в чернодробните тъкани на плъхове с модел NAFLD.

CHLZT индуцирана експресия на p-AMPKα и PPARγ, но инхибира експресията на ACC-α, p-ACC-α, SREBP-2 и HMGR при плъхове NAFLD

За да се открие сигнализацията надолу по веригата на AMPKα, бяха открити нивата на PPARy, ACC-α, p-ACC-α и SREBP-2 при плъхове. В съответствие с резултатите от IHC оцветяване за p-AMPKα, нивата на p-AMPKα в моделната група са значително по-ниски от тези в контролната група. Леченията с CHLZT или AICAR значително повишават нивата на p-AMPKα при плъховете с модел NAFLD (Фигура 3А). Освен това нивата на ACC-α и p-ACC-α при моделните плъхове са значително по-високи от тези при контролните плъхове. Леченията с CHLZT или AICAR значително намаляват нивата на ACC-α и p-ACC-α при плъховете на модела NAFLD (Фигура 3А). В сравнение с нивата в контролните плъхове, нивата на PPARy mRNA и протеин са значително намалени при моделните плъхове. Обработките с CHLZT или AICAR значително намаляват нивата на PPARy mRNA и протеини в плъховете на модела NAFLD (Фигура 3А, В). Нивата на SREBP-2 иРНК и протеин в моделните плъхове са значително по-високи от тези в контролните плъхове. Леченията с CHLZT или AICAR значително повишават нивата на PPARy mRNA и протеини при плъхове с модел NAFLD (Фигура 3А, В). Нивата на HMGR при моделните плъхове са значително по-високи от тези при контролните плъхове (Фигура 3С). Леченията с CHLZT или AICAR значително намаляват нивата на HMGR при плъхове с модел NAFLD.

Експресия на AMPKα, p-AMPKα, PPARγ, ACC-α, p-ACC-α, SREBP-2 и HMGR в чернодробните тъкани

CHLZT инхибира агрегацията на липиди, но индуцира фосфорилирането на AMPKα в NAFLD клетки

HepG2 чернодробните клетки се култивират в среда, съдържаща дълговерижна мастна емулсия, за да се установи NAFLD клетъчен модел. След като клетките с модел NAFLD бяха третирани със CHLZT-съдържащ серум или AICAR, оцветяването с Oil Red O показа, че тези лечения са инхибирали липидната агрегация в клетъчната цитоплазма (Фигура 4А). Фосфорилирането на AMPKa в клетките се открива чрез оцветяване с имунофлуоресценция (Фигура 4В). Лечението със CHLZT-съдържащ серум или AICAR индуцира фосфорилирането на цитоплазмен AMPKα.

Ефект на CHLZT-съдържащ серум върху липидната агрегация и фосфорилиране на AMPKα в NAFLD клетки

CHLZT индуцирана експресия на p-AMPKα и PPARγ, но инхибира експресията на ACC-α, p-ACC-α, SREBP-2 и HMGR в NAFLD клетки

Нивата на PPARy, ACC-α, p-ACC-α и SREBP-2 в NAFLD клетки също бяха открити (Фигура 5А). В сравнение с техните нива в контролните клетки, нивата на p-AMPKα и PPARy в клетки, третирани със CHLZT-съдържащ серум или AICAR са значително увеличени. Нивата на ACC-α и p-ACC-α бяха значително намалени при лечение със CHLZT-съдържащ серум или AICAR (Фигура 5А). Нещо повече, нивата на PPARy иРНК и протеин са значително увеличени от CHLZT-съдържащите серум и AICAR лечения, докато нивата на SREBP-2 иРНК и протеин са значително намалени от тези лечения (Фигура 5А, В). Леченията с CHLZT или AICAR също значително намаляват нивата на HMGR в клетките на модела NAFLD (Фигура 5С).

Експресия на AMPKα, p-AMPKα, PPARγ, ACC-α, p-ACC-α, SREBP-2 и HMGR в NAFLD клетки

Дискусия

Китайската медицина CHLZT е ефективна за защита срещу NAFLD

Схематична диаграма, показваща как китайската медицина CHLZT намалява нивата на липидите в NAFLD чрез засилване на експресията на PPARγ, насърчаване на фосфорилирането на AMPKα и инхибиране на експресията на SREBP-2, фосфорилирането на ACC-α и активността на HMGR.

Схематична диаграма, показваща как китайската медицина CHLZT намалява нивата на липидите в NAFLD чрез засилване на експресията на PPARγ, насърчаване на фосфорилирането на AMPKα и инхибиране на експресията на SREBP-2, фосфорилирането на ACC-α и активността на HMGR.

PPAR-γ намалява инсулиновата резистентност чрез регулиране на инсулиновата чувствителност и насърчаване на синтеза на адипонектин [39,40]. Като ключов ензим, участващ в окисляването на мастните киселини, PPAR-γ регулира всички аспекти на метаболизма на мастните киселини и насърчава усвояването на свободни мастни киселини и съхранението на TG [41]. В допълнение, PPAR-γ индуцира диференциация на адипоцитите и неговата експресия се увеличава с диференциацията на адипоцитите [42]. Установихме, че CHLZT повишава нивата на PPAR-γ, което може да допринесе за диференциацията на адипоцитите. Много изследвания потвърждават, че SREBPs, като SREBP2, не само играят важна роля в регулирането на метаболизма на мастните киселини, но също така помагат за облекчаване на дисфункцията на автофагията и участват в синтеза и абсорбцията на TC, фосфолипиди и други вещества, така че да поддържат хомеостазата на липидите при животните [43]. Установихме, че CHLZT намалява нивата на SREBP2 в чернодробните тъкани и клетки на NAFLD.

В заключение, CHLZT предпазва от NAFLD чрез активиране на AMPKα, инхибиране на ACC активността, регулиране надолу на SREBP2 и HMGR и регулиране на нагоре PPAR-γ. Нашите открития могат да помогнат за подобряване на клиничните резултати при пациенти с NAFLD.

Финансиране

Тази работа беше подкрепена от Програмата за ключови изследвания и развитие на провинция Шанси в Китай [номер на безвъзмездна помощ 201603D3113021].

Конкуриращи се интереси

Авторите заявяват, че с ръкописа няма свързани конкурентни интереси.