Jiachao Zhang

1 Колеж по хранително инженерство и хранителни науки, Нормален университет Шанси, Сиан, Китай

2 Колеж по хранителни науки и технологии, Hainan University, Haikou, Китай

Zhaoxia Wang

1 Колеж по хранително инженерство и хранителни науки, Нормален университет Шанси, Сиан, Китай

Dongxue Huo

2 Колеж по хранителни науки и технологии, Hainan University, Haikou, Китай

Юю Шао

1 Колеж по хранително инженерство и хранителни науки, Нормален университет Шанси, Сиан, Китай

Свързани данни

Резюме

Въведение

Някои лекарства, които се използват за лечение на чернодробни заболявания, имат странични ефекти (7). Следователно е от съществено значение да се търсят потенциални функционални храни, които предотвратяват/предпазват от увреждане на черния дроб, но нямат (или малко) странични ефекти. Млякото е богато на хранителни вещества, особено козе мляко, което е по-лесно смилаемо и усвоимо от кравето мляко поради по-малките си казеинови мицели и мастни глобули и високите нива на средно- и късоверижни мастни киселини (SCFA) (8 ). Консумацията на козе мляко може да предпази клетките от нараняване и се използва като средство за лечение на чернодробна мастна инфилтрация при деца (9). Това показва, че козето мляко може да има потенциални хепатопротективни качества, които трябва да бъдат допълнително проучени.

Материали и методи

Мишки и експериментален протокол

Мъжки мишки C57BL/6 (на 12 седмици) бяха оставени да се аклиматизират към съоръжението за животни в продължение на 1 седмица преди началото на експеримента. Мишките бяха държани в отделни проветриви клетки в контролирани от климата помещения (12 часа цикли светлина/тъмнина; 20–24 ° C; 45–55% RH; индивидуален филтриран стерилизиран въздух) с достъп до храна и вода ad libitum. Всички използвани храни, вода и експериментално оборудване бяха стерилизирани или санирани. Животните са получили хуманни грижи от обучен персонал и всички експерименти са извършени в съответствие с насоките на Научния комитет по етика на нормалния университет в Шанси.

предпазва

Експериментален дизайн (А) и хистологичен анализ на черния дроб от осемте различни третирани групи мишки (виж фигура Фигура 1А) 1 А) (Б) (1). Чернодробни проби, взети 1 ден след прилагане на CCl4 (за определяне на превантивни ефекти от консумацията на мляко върху индуцирано чернодробно увреждане) от нетретирани контролни мишки UPrev (a), моделни мишки MPrev (b), мишки, получаващи козе мляко GPrev (c), и мишки получаване на краве мляко CPrev (d) и 8 дни след прилагане на CCl4 (за определяне на защитни ефекти от продължителната консумация на мляко върху индуцирано чернодробно увреждане) от нетретирани контролни мишки UProt (i), моделни мишки MProt (j), мишки, получаващи козе мляко GProt (k) и мишки, получаващи краве мляко CProt (l) (2). Чернодробна хистология [хематоксилин и еозин (H&E)] на UPrev (e), MPrev (f), GPrev (g), CPrev (h), UProt (m), MProt (n), GProt (o) и CProt (p ) мишки. Мащабна лента: 100 µm за e – h и m – p.

Оценка на превантивната роля на млякото при увреждане на черния дроб, предизвикано от CCl4

От 1-7 дни мишките в лечебните групи UPrev и MPrev получават 10 ml/kg телесно тегло стерилизирана дестилирана вода чрез интра-стомашно приложение два пъти дневно; мишки в лечебни групи GPrev и CPrev са получавали съответно 10 ml/kg телесно тегло козе мляко UHT-кози и 10 ml/kg телесно тегло търговско мляко UHT крави, отново два пъти на ден чрез интра-стомашно приложение.

На 8-мия ден мишките от групата UPrev са получили интраперитонеална инжекция от 1 ml/kg телесно тегло зехтин; мишки в групи MPrev, GPrev и CPrev получиха интраперитонеална инжекция от 1 ml/kg телесно тегло CCl4 (1: 4, v/v, в зехтин). След 24 часа (ден 9) всички мишки бяха анестезирани с изофлуран газ и при асептични условия, лапаротомии, извършени чрез разрез по средната линия и проби, събрани от дебелото черво за оценка на микробиотата на червата. Взети са кръвни проби и черният дроб се събира, замразява се в течен азот и се съхранява при -80 ° C за допълнителен анализ.

Оценка на защитните ефекти на млякото върху увреждания на черния дроб, предизвикани от CCl4

Мишките от останалите четири групи бяха използвани за оценка на защитните ефекти на продължителната консумация на мляко и бяха третирани по същия начин като мишките в превантивния експеримент, до ден 9, но след това, вместо да бъдат жертвани, мишки UProt, MProt, GProt и CProt продължи да получава стерилизирана дестилирана вода, козе мляко или краве мляко за още 7 дни. На 16-ия ден всички останали мишки бяха умъртвени и пробите бяха събрани, както беше описано по-рано.

Хистологичен анализ

Пробите от левия лоб на черния дроб бяха фиксирани в 4% параформалдехид (4 ° C), дехидратирани в градуиран алкохол и вградени в парафинов восък. Вградените тъкани се нарязват на участъци с дебелина 4 µm и се оцветяват с хематоксилин и еозин за морфологичен анализ.

Анализи на аланин трансаминаза (ALT) и аспартат трансаминаза (AST)

ALT и AST се разпределят главно в чернодробните клетки и когато мембраните на чернодробните клетки са повредени или претърпяват некроза, тези ензими навлизат в серума в големи количества. Определянето на активността на серумните или плазмените ензими може чувствително да отразява степента на увреждане на черния дроб (18). Серумът се събира чрез центрофугиране (2000 х g за 15 минути, 4 ° С). Нивата на ALT и AST бяха определени с помощта на търговския комплект за анализ на активността на ALT (MAK052) и комплект за анализ на активността на AST (MAK055) в съответствие с инструкциите на производителя (Sigma-Aldrich, Inc.). Всяка проба се анализира три пъти.

Анализи на малондиалдехид (MDA), супероксиддисмутаза (SOD) и глутатион (GSH)

Проби от черен дроб се претеглят и хомогенизират за 1 min във фосфатен буфер (рН 7,4). Хомогенатите се центрофугират при 2000 х g и 4 ° С в продължение на 20 минути и супернатантата се събира внимателно. Концентрациите на MDA, SOD и GSH в супернатантите бяха определени с помощта на комплекти за мишка MDA, SOD и GSH ELISA в съответствие с инструкциите на производителя (MDA, ml931407; SOD, ml643059; GSH, ml643115; Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd) . Всяка проба се анализира три пъти.

Количествен RT-PCR анализ

Измерихме нивата на експресия на иРНК на гените за ключовите ензими CYP2E1, който влияе върху активирането на CCl4 in vivo и TNF-α, който е противовъзпалителен цитокин. Обща РНК беше извлечена от проби от 50 mg чернодробна тъкан, използвайки TRIzol ®, съгласно протокола на производителя. Проба РНК се транскрибира в кДНК с помощта на SuperScript III RT-PCR кит и след това се извършва количествена PCR във флуоресцентен температурен циклер със SYBR Green и специфични праймери за всеки от гените. Всяка реакция се повтаря независимо поне три пъти. Глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназата (GAPDH) се усилва като вътрешен контрол. Последователностите на праймерите, използвани за всеки ген, са изброени в Таблица Таблица1. 1. pcr данните от масива бяха изчислени по метода 2 - (ΔΔCt).

маса 1

PCR праймери, използвани в това изследване.

GeneForwardReverse
CYP2E1TTTCCCTAAGTATCCTCCGTGACCGTAATCGAAGCGTTTGTTGA
TNF-αTGAGGTCAATCTGCCCAAGTCTGAGCCATAATCCCCTTTCTA
GAPDHGGTTGTCTCCTGCGACTTCATGGTCCAGGGTTTCTTACTCC
16S рРНК ген (V3 – V4 региони)ACTCCTACGGGAGGCAGCAGGACTACHVGGGTWTCTAAT

Метагеномна ДНК екстракция и високопроизводително секвениране на V3 – V4 региони на 16S rRNA ген

Екстракция и анализ на метагеномна ДНК от микробиома, присъстващ в пробите на дебелото черво, се извършва с помощта на описаните по-рано методи (19). Областите V3-V4 на гена 16S rRNA се амплифицират, използвайки специфични праймери (праймер 338F и обратен праймер 806R; Таблица Таблица1) 1) (20). PCR продуктите се пречистват с помощта на комплект за екстракция на гел Qiagen. За конструиране на ДНК библиотека беше използван TruSeq ® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit. ДНК библиотеката е количествено определена с помощта на Qubit Fluorometer и Agilent Bioanalyzer 2100; последователността беше направена с помощта на система Illumina HiSeq 2500.

Биоинформатичен анализ на последователни данни

250 bp сдвоени четения са генерирани чрез последователност; анализът на биоинформатиката, който използвахме за тези данни за последователността, е напълно описан по-рано (8, 19, 20). Накратко, Qiime pipeline (v1.7.0) беше използван за филтриране на нискокачествени маркери. Използван е софтуер Uparse (v7.0.1001) за групиране на ефективни маркери към оперативната таксономична единица (OTU) въз основа на 97% сходство на последователността на последователностите. Представителни OTU с висока честота на поява бяха избрани и анотирани за таксономична информация, използвайки метода на Mothur и базата данни SSUrRNA в SILVA с праг от 0.8–1, за да се получат състави на общността на различни таксономични нива (тип и род). Бяха извършени множество подравнявания на последователности с помощта на софтуера MUSCLE за изследване на филогенетични връзки между различни OTU и преобладаващите бактерии в чревната микробиота.

Статистически анализ

Анализът на разликите между две или повече групи беше извършен с помощта на непараметричния тест на Wilcoxon rank-sum и теста на Kruskal – Wallis H. Лентите с данни и грешки са представени като средно ± стандартна грешка на средното. Статистическата значимост се приемаше, когато стойността на P беше по-малка от 0,05. Всички статистически анализи бяха извършени в R софтуер.

Номер за присъединяване на нуклеотидна последователност

Данните за последователност с висока производителност, докладвани в това проучване, са депозирани в базата данни на NCBI и номерът за присъединяване е PRJNA437795.

Резултати

Хистологичен анализ

Превантивна роля на млякото при CCl4-индуцирани увреждания на черния дроб

Защитна роля на млякото при CCl4-индуцирани увреждания на черния дроб

Осем дни след инжектиране на CCl4, чернодробната тъкан и структурата на чернодробните лобули на мишки MProt (Фигура (Фигура 1B-j, n), 1 Bj, n), мишки GProt (Фигура (Фигура 1B-k, o), 1 Bk, o ) и CProt мишки (Фигура (Фигура 1B-l, p) 1 Bl, p) бяха подобни на тези от мишките UProt (Фигура (Фигура 1B-i, m). 1 Bi, m). Некротичната област на чернодробната тъкан изчезна и структурата на чернодробната лобула се нормализира, което показва, че тъканта е възстановена.

Анализи на ALT и AST

Превантивна роля на млякото при CCl4-индуцирани увреждания на черния дроб

Двадесет и четири часа след прилагане на CCl4, нивата на ALT в серума от мишки MPrev и GPrev са били 72 и 35 пъти по-високи от тези на мишки UPrev (Фигура (Фигура 2А). 2 А). Нивата на AST в серума от мишките MPrev и GPrev са били 17 и 9 пъти по-високи от тези на мишките UPrev (Фигура (Фигура 2В). 2 В). Всички разлики между представените по-горе групи са статистически значими (P Фигура 1А). 1 А). Взети са проби 1 ден след прилагане на CCl4 (за определяне на превантивни ефекти от консумацията на мляко върху индуцирано чернодробно увреждане) от: нетретирани контролни мишки (UPrev), моделни мишки (MPrev), мишки, получаващи козе мляко (GPrev), и мишки, приемащи крави „мляко (CPrev) и 8 дни след прилагане на CCl4 (за определяне на защитни ефекти от продължителната консумация на мляко върху индуцирано чернодробно увреждане) от нетретирани контролни мишки (UProt), моделни мишки (MProt), мишки, получаващи козе мляко (GProt), и мишки, получаващи краве мляко (CProt). Индексите бяха както следва: аланин трансаминаза (ALT) (А), аспартат трансаминаза (AST) (Б), малоносов диалдехид (MDA) (° С), супероксиддисмутаза (SOD) (Д), и глутатион (GSH) (E). Лентите с данни и грешки са представени като средно ± SEM. * Р 0,05). Това показва, че пиковото увреждане на черния дроб е настъпило 24 часа след инжектиране на CCl4 и че степента на увреждане на черния дроб в групата на мишките с козе мляко е значително по-ниска, отколкото в групата на модела и в групата на кравето мляко, което е паралелно с хистопатологичните находки. Това показва, че козето мляко предпазва от остро увреждане на черния дроб, предизвикано от CCl4, и може да ускори възстановяването на увредената тъкан.

MDA, SOD и GSH анализи

Превантивна роля на млякото при CCl4-индуцирани увреждания на черния дроб

Двадесет и четири часа след инжектиране на CCl4, нивата на MDA в чернодробните тъкани на мишките MPrev бяха значително по-високи, отколкото в чернодробните тъкани на мишките UPrev и GPrev (P Фигура2C); 2 ° С); Нивата на MDA са значително по-високи в чернодробните тъкани на мишките GPrev в сравнение с мишките UPrev (P Фигура 2C). 2 С). Нивата на SOD и GSH в чернодробните тъкани на мишките MPrev са значително по-ниски от тези на мишките UPrev (P Фигури 2D, E), 2 D, E), но няма значителна разлика в нивата на GSH при мишките GPrev в сравнение с мишките UPrev (P > 0,05).

Защитна роля на млякото при CCl4-индуцирани увреждания на черния дроб

Нивата на MDA в чернодробните тъкани на мишки MProt са значително по-високи, отколкото в чернодробните тъкани на мишки UProt и GProt (P Фигура 2С). 2 С). Няма значителна разлика между нивата на MDA при мишки GProt и UProt (P> 0,05). Нивата на SOD и GSH са значително по-ниски при мишки MProt, отколкото при мишки UProt (P Фигури 2D, E), 2 D, E), но няма значителни разлики в нивата на SOD и GSH между мишките GProt и мишките UProt (P> 0,05).