Център за спорт, упражнения и науки за живота, Университет Ковънтри, Ковънтри, Великобритания

Тези автори допринесоха еднакво за тази работа. Потърсете още статии от този автор

School of Life Sciences, Coventry University, Coventry, UK

Тези автори допринесоха еднакво за тази работа. Потърсете още статии от този автор

School of Life Sciences, Coventry University, Coventry, UK

School of Life Sciences, Coventry University, Coventry, UK

Център за спорт, упражнения и науки за живота, Университет Ковънтри, Ковънтри, Великобритания

Моретън Морел колеж ферма, колеж Уорикшир, Уорикшир, CV35 9BL Великобритания

School of Life Sciences, Coventry University, Coventry, UK

Училище за естествени науки и психология, Ливърпул Университет Джон Мурс, Ливърпул, Великобритания

За кореспонденция. Имейл [email protected]; Тел. + (44) 24776 58794. ** Имейл [email protected]; Тел. +44 (0) 151 231 2542.

Център за спорт, упражнения и науки за живота, Университет Ковънтри, Ковънтри, Великобритания

За кореспонденция. Имейл [email protected]; Тел. + (44) 24776 58794. ** Имейл [email protected]; Тел. +44 (0) 151 231 2542.

Център за спорт, упражнения и науки за живота, Университет Ковънтри, Ковънтри, Великобритания

Тези автори допринесоха еднакво за тази работа. Потърсете още статии от този автор

School of Life Sciences, Coventry University, Coventry, UK

Тези автори допринесоха еднакво за тази работа. Потърсете още статии от този автор

School of Life Sciences, Coventry University, Coventry, UK

School of Life Sciences, Coventry University, Coventry, UK

Център за спорт, упражнения и науки за живота, Университет Ковънтри, Ковънтри, Великобритания

Моретън Морел колеж ферма, колеж Уорикшир, Уорикшир, CV35 9BL Великобритания

School of Life Sciences, Coventry University, Coventry, UK

Училище по естествени науки и психология, Ливърпул Университет Джон Мурс, Ливърпул, Великобритания

За кореспонденция. Имейл [email protected]; Тел. + (44) 24776 58794. ** Имейл [email protected]; Тел. +44 (0) 151 231 2542.

Център за спорт, упражнения и науки за живота, Университет Ковънтри, Ковънтри, Великобритания

За кореспонденция. Имейл [email protected]; Тел. + (44) 24776 58794. ** Имейл [email protected]; Тел. +44 (0) 151 231 2542.

Информация за финансиране:

DAD беше подкрепен от гранта на NERC на IM (NE/N019288/1), а MTFL беше подкрепен от изследователския център за спорт, упражнения и науки за живота на Факултета по здравни науки, Университет Ковънтри.

Обобщение

Въведение

Чревната микробиота е от решаващо значение за хомеостазата при хора и животни и представлява естествен резервоар от гени за устойчивост на антибиотици (Salyers и др., 2004; Dethlefsen и др., 2007; Сомър и др., 2009; Алън и др., 2010). Антибиотиците (AB) често се използват в животновъдството за предотвратяване и лечение на инфекции, както и в развиващите се страни за подпомагане на растежа, въпреки насърчаването на бързото развитие на устойчиви на множество лекарства патогени, включително тези, устойчиви на „антибиотици от последна инстанция“, като колистин ( Cabello, 2006; McEwen, 2006; Martínez, 2008; Hasman и др., 2015 г .; Лиу и др., 2016 г .; Патерсън и Харис, 2016). Също така, отдавна се смята, че такива лечения директно подбират бактерии, устойчиви на предписания антибиотик, което води до появата на резистентност, определяща специфично за прилагания антибиотик (напр. Hayden и др., 2005; Санчес Гарсия и др., 2010; Ендимиани и др., 2011). Изглежда обаче, че лечението на АБ причинява по-общия дисбаланс на дисбиозата на микробиотата, който може да има допълнителни ефекти, включително непропорционално увеличаване на изобилието от специфични бактерии, които могат да носят подвижни елементи, съдържащи гени за резистентност към много лекарства (Barlow, 2009; Shin и др., 2015 г.) и/или свързано със затлъстяване.

Тук телетата, настанени и отглеждани при контролирани условия, са били изложени на превантивна антибиотична терапия с флорфеникол; търговско наименование Nuflor за оценка на ефектите върху резистома и чревната микробиота. Това е първият доклад за молекулярен анализ на микробиотата на телешките черва в отговор на превантивна антибиотична терапия, която предразполага животните към дисбиоза и заболявания, насърчавайки растежа на бактерии, които носят силно мобилни клинично значими съпротивления, които могат да бъдат предадени на хората.

Резултати

Лечението с антибиотици води до дисбалансирана микробна общност в червата на животните

Дълбокото секвениране на 18 проби дава 5 578 146 четения на последователност на V3 – V4 хиперпроменливи области на бактериалната 16S рДНК; 2 888 547 от медикаментозни и 2 689 599 от нелечени телета. Във всяка проба бяха идентифицирани до 10 различни бактериални тила (фиг. 1А), заедно с метаногенни Архея (Фиг. 2). Преобладаващата фила бяха Фиксира (64 ± 1,7%) и Бактероидети (26 ± 2,6%; фиг. 1А и 1), за които е доказано, че са най-разпространени в човешките и животинските черва (Екбург и др., 2005; Sun and Chang, 2014). При по-ниско разпространение бяха Захарибактерии, Тенерикути, Спирохети, Актинобактерии, Протеобактерии, Verrucomicrobia и Цианобактерии. С изключение Протеобактерии, общото разпространение на phyla не се е променило значително в отговор на антибиотично лечение (фиг. 1В и 1).

лечение

Поява на Е. coli носещи мобилни mcr ‐ 2, поддръжка на oqxB гени и резистентност към клинични антибиотици в отговор на флорфеникол

Присъствието на плазмида pOLA52 в третираните проби при Т7 се потвърждава чрез секвениране на Sanger на вложени PCR на метагеномната ДНК, насочена към произволно избрана последователност от 215 bp в плазмида. Тези резултати категорично предполагат, че превантивното антибиотично лечение на здрави животни насърчава растежа на Е. coli които носят клинично значими гени на резистентност върху подвижни елементи, увеличавайки риска от разпространение на резистентност в популациите на фермите и хората.

Дискусия

Взети заедно, предизвикано от антибиотици дисбиотично разширяване на факултативно анаеробно Е. coli може да предразположи гостоприемника към заболяване, като чревно възпаление и рак. Той също така може да управлява Enterobacteriaceae колонизация на ентеричен патоген, която носи клинично значими трансмисивни антибактериални съпротивления. Следователно практиките за превантивно антибиотично лечение на здрави животни трябва да вземат предвид потенциалната заплаха за здравето на животните, както и високия риск от зоонозен трансфер на патогени, носещи мобилна съпротива към човешката популация.

Последствия

Лечението с телета с флорфеникол води до промени в чревната микробиота, така че тя прилича на тази при затлъстели хора/животни без никакви промени в диетата. Затлъстяването е основна обществена и клинична здравна грижа, засягаща около 400 милиона души в световен мащаб. Докато диетата допринася за разнообразието на чревната микробиота (Bäckhed и др., 2005) и засяга телесната маса, но е показано, че това увеличение може да настъпи без промени в консумацията на храна (Ley и др., 2006). Следователно, подобрената способност за събиране на енергия на здравата чревна микробиота в отговор на антибиотика може да допринесе за повишен енергиен прием, като същевременно се запази същият прием на храна. Следователно неговото потенциално въздействие върху затлъстяването трябва да бъде взето предвид от здравните специалисти по време на лечението на клинични инфекции.

Експериментални процедури

Проби

Изолация и секвениране на геномна ДНК

Общата геномна ДНК (gDNA) се екстрахира с помощта на QIAamp® DNA Stool Kit (QIAGEN®). 0,2 g клетъчни пелети бяха суспендирани повторно в 180 μl 1 × PBS и обработени в съответствие с инструкциите на производителя. Концентрацията на пречистена gDNA беше измерена чрез спектрофотометрия при А260. Общата ДНК се използва за секвениране на цели (мета) геноми и като шаблон за амплифициране и секвениране на V3-V4 хипервариабилни области на бактериалната 16S малка субединица на рибозомния РНК ген за метагеномно профилиране. Подробности за протоколите за секвениране, включително последователности от праймери, са дадени в Приложение S1. Всички данни за последователността бяха подадени в Европейския нуклеотиден архив (ENA), в рамките на проучването PRJEB33144 (за данните за 16S rRNA) и PRJEB33145 (за всички данни за последователността на метагеномната пушка).

Метагеномно профилиране на бактериални съобщества

Профилиране на „резистома“ на бактериалната общност, като се използва последователност от метагеномни пушки на целия геном

За да се анализира „резистома“ във всяка проба, от Resfinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/) са получени групи гени, свързани с резистентност, и са използвани за създаване на набор от бази данни, подходящи за използване с BLAT (Кент, 2002). Четенията бяха обработени чрез премахване на последователността на последователността на адаптера на библиотеката, използвайки cutadapt v1.9.1 (Martin, 2011), запазвайки само четения, по-дълги от 50 bp и не съдържащи N след изрязване. Подрязаните четения бяха преобразувани във формат FASTA и „де-реплицирани“ (идентичните четения се свиха в едно четене), използвайки vsearch v1.1.1 (Pruesse и др., 2012). Това беше направено, за да (i) направи по-късния анализ по-ефикасен в изчислителни функции и (ii) да позволи на артефакти като PCR дубликати да бъдат отчетени при по-късни анализи. Де-реплицираните четения от всяка проба бяха търсени спрямо всеки ген, като се използва BLAT (Kent, 2002). Всички гени за четене и целеви гени бяха преведени във всичките шест рамки за четене и подравнени като протеини, за да улавят четения от видове, по-отдалечени от „референтните“ последователности. Четенията, съвпадащи с „референтни“ последователности във всяка „база данни“, се определят количествено като броя на съвпаденията на уникални последователности (т.е. де-реплицирани четения) и общия брой на съвпаденията (т.е. включително множество идентични четения) и се изразяват като брой и пропорции от общия размер на библиотеката.

Полуколичествено PCR усилване на 16S рРНК и uidA гени

Значително увеличение на ДНК-seq отчита Ешерихия spp. при T7 е валидиран чрез полуколичествена PCR за uidA ген и използване на гена 16S rRNA като контрол за нормализиране. Условията за PCR са представени в Приложение S1.

PCR, клониране и Sanger секвениране на mcr ‐ 2 и oqxB гени

За потвърждаване на данните за ДНК-последователност по отношение на появата на mcr ‐ 2 ген и наличие или отсъствие на oqxB се извършва визуализация на вложени PCR ленти, последвано от клониране и секвениране на Sanger. Подробности за подходите за клониране са описани в допълнение S1.

Молекулярно моделиране

Молекулярните модели на OqxA и OqxB са генерирани, използвайки кристалната структура на AcrAB-TolC Multidrug Efflux Pump (PDB 5V5S.pdb), използвайки Modeller (Sali and Blundell, 1993). Сто модела бяха генерирани и първоначално класирани с помощта на OPUS_PSP (Lu и др., 2008). Пет модела с най-висок резултат са усъвършенствани с помощта на мембранния протеинов модул от Rosetta (Alford и др., 2015). Точкови мутации бяха направени в дивия тип последователност с помощта на Rosetta. Промените във вторичната структура и относителните движения на елементите на вторичната структура бяха анализирани с помощта на вътрешен скрипт на python.

Статистически анализ

rDNA-seq четенията бяха нормализирани между пробите до общия брой четения на пробите и представени като процент от общия брой четения. За да се изследват всякакви разлики в бактериалния състав във времето и между лекуваната и контролната групи, бяха проведени поредица от 2 (инжектирани срещу контролни, нелекарствени) × 3 (времеви точки) повторни мерки ANOVA (SPSS v.24), и тестът на Бенджамини-Хохберг, процентът на фалшивите открития (критичната стойност от 2014 г.). Когато са били очевидни значителни разлики, са били използвани сравнения по двойки post hoc, за да се определи къде са разликите и където е подходяща стандартна грешка при 95% доверителен интервал.

Благодарности

DAD беше подкрепен от безвъзмездна помощ от NERC на IM (NE/N019288/1), а MTFL беше подкрепен от изследователския център за спорт, упражнения и науки за живота на Факултета по здравни науки към университета в Ковънтри. Бихме искали да благодарим на S. Tompsett и S. Andrews за техническа помощ.

Конфликт на интереси

Авторите не декларират конфликт на интереси.

Принос на автора

L.A., J.R. и I.Y.M. проектирани изследвания; D.A.D., M.T.F.L., S.C. и I.Y.M. извършени изследвания; M.D. и I.Y.M извършиха статистически анализ; D.A.D., M.T.F.L., G.D.W., J.S., L.A. и I.Y.M. анализирани данни; и M.T.F.L., G.D.W, J.R. и I.Y.M. написа вестника.

Фиг. S1. Оценка на увеличение на Е. coli ниво в отговор на лечението с Nuflor. За полуколичествено PCR усилване бяха използвани поредица от разреждания на едни и същи набори gDNAs (240 ng, 120 ng или 60 ng) при To и T7 за 16S RNA- и uidA гени. 1 и 3, 573 nts PCR фрагмент на uidA при T7 и To, съответно; 2 и 4, 500 nts PCR фрагмент на 16S РНК гена при Т7 и То, съответно. От този анализ стана ясно, че пробата To uidA генерира сигнал