От Istituto Neurologico Mediterraneo “Neuromed” (B.G., S.R., R.S., A.L., M.V.), Pozzilli (Is); секция по патология, Катедра по биохимия и биофизика „F. Cedrangolo, ”Втори университет в Неапол (A.B., F.B.), Неапол Италия; и Катедрата по патология и експериментална медицина, Университет La Sapienza (S.R., M.V.), Рим, Италия.

От Istituto Neurologico Mediterraneo “Neuromed” (B.G., S.R., R.S., A.L., M.V.), Pozzilli (Is); секция по патология, Катедра по биохимия и биофизика „F. Cedrangolo, ”Втори университет в Неапол (A.B., F.B.), Неапол Италия; и Катедрата по патология и експериментална медицина, Университет La Sapienza (S.R., M.V.), Рим, Италия.

От Istituto Neurologico Mediterraneo “Neuromed” (B.G., S.R., R.S., A.L., M.V.), Pozzilli (Is); секция по патология, Катедра по биохимия и биофизика „F. Cedrangolo, ”Втори университет в Неапол (A.B., F.B.), Неапол Италия; и Катедрата по патология и експериментална медицина, Университет La Sapienza (S.R., M.V.), Рим, Италия.

От Istituto Neurologico Mediterraneo “Neuromed” (B.G., S.R., R.S., A.L., M.V.), Pozzilli (Is); секция по патология, Катедра по биохимия и биофизика „F. Cedrangolo, ”Втори университет в Неапол (A.B., F.B.), Неапол Италия; и Катедрата по патология и експериментална медицина, Университет La Sapienza (S.R., M.V.), Рим, Италия.

От Istituto Neurologico Mediterraneo “Neuromed” (B.G., S.R., R.S., A.L., M.V.), Pozzilli (Is); секция по патология, Катедра по биохимия и биофизика „F. Cedrangolo, ”Втори университет в Неапол (A.B., F.B.), Неапол Италия; и Катедрата по патология и експериментална медицина, Университет La Sapienza (S.R., M.V.), Рим, Италия.

От Istituto Neurologico Mediterraneo “Neuromed” (B.G., S.R., R.S., A.L., M.V.), Pozzilli (Is); секция по патология, Катедра по биохимия и биофизика „F. Cedrangolo, ”Втори университет в Неапол (A.B., F.B.), Неапол Италия; и Катедрата по патология и експериментална медицина, Университет La Sapienza (S.R., M.V.), Рим, Италия.

От Istituto Neurologico Mediterraneo “Neuromed” (B.G., S.R., R.S., A.L., M.V.), Pozzilli (Is); секция по патология, Катедра по биохимия и биофизика „F. Cedrangolo, ”Втори университет в Неапол (A.B., F.B.), Неапол Италия; и Катедрата по патология и експериментална медицина, Университет La Sapienza (S.R., M.V.), Рим, Италия.

Преглеждате най-новата версия на тази статия. Предишни версии:

Резюме

Склонният към инсулт спонтанно хипертоничен щам на плъх (SHRSP) развива тежка форма на хипертония и показва висока честота на наранявания в различни съдови легла. По-специално, хистологичните лезии в бъбречната васкулатура и паренхима често се наблюдават при този модел на животни, докато те са по-леки или дори липсват в неговия тясно свързан щам на плъхове, устойчив на инсулт спонтанно хипертоничен плъх (SHR), 1,2 от който SHRSP е извлечена. 3

В действителност, тежка бъбречна недостатъчност не се наблюдава постоянно при SHRSP, вероятно защото по време на установяването на този щам тази допълнителна черта би довела до нетърпимо намаляване на физическата форма. 3 От друга страна, предишни проучвания показват, че развитието на бъбречни лезии предхождат цереброваскуларните лезии и предполагат, че те участват в патогенезата на инсулта в този модел. 2,4 В това последно отношение високите нива на кръвното налягане, аномалиите в системата ренин-ангиотензин и повишеният прием на сол са признати за важни фактори в патогенезата на церебралните, както и на бъбречните съдови лезии в този щам. 2,5 Съвсем наскоро обаче елегантните експерименти с бъбречна трансплантация посочиха централната роля на генетичните фактори за появата на бъбречно увреждане в SHRSP. 6

Експерименти, проведени от нашата група, преди са изследвали ролята на генетичните фактори в патогенезата на инсулт 7 и на ендотелната дисфункция 8 в SHRSP чрез анализ на гесетип/фенотип на косегрегация на тези 2 белези в SHRSP/SHR F2 интеркос. При това кръстосване повишените нива на кръвното налягане не се разделят, докато латентността към инсулт 7,9 и увреждането на ендотелната функция 8,9 се разделят, заедно с чувствителността към диета с високо съдържание на сол и ниско съдържание на калий.

Целта на настоящото проучване беше да се изследва потенциалната роля на генетичните фактори в податливостта към бъбречни хистологични лезии в SHRSP/SHR F2 между кръстосването чрез използване на голям панел от полиморфни маркери между 2 родителски щама. 10

Методи

Животни

Изследвана е кохорта от 154 F2-хибридни плъхове (79 мъжки, 75 женски), получени от оригиналните колонии SHR и SHRSP, установени в Япония през 1974 г., съгласно Насоките за изследване на животните на нашата институция.

Плъховете се държат на постоянна температура с 12-часов цикъл ден-нощ, със свободен достъп до редовна чау и вода. На 6-седмична възраст плъховете бяха прехвърлени на диета, позволяваща инсулт (диета в японски стил) (Laboratori Dottori Piccioni), с променено съотношение натрий/калий, ниско съдържание на протеин и NaCl 1% добавка в питейната вода за 4 седмици. По това време систоличното кръвно налягане (SBP) се измерва неинвазивно при съзнателни задържани плъхове с помощта на сфигмоманометрия с маншет (PE-300, Narco Biosystem Inc). За да се сведе до минимум вариабилността на тази техника, бяха получени множество (n = 5) измервания за всеки плъх, след като те бяха свикнали с устройството. За да се избегне объркващият ефект от предсказуемата поява на инсулт и смърт, които могат да настъпят след няколкоседмично излагане на японската диета, на този етап плъховете бяха убити.

Определение на хистологията и фенотипа

Фигура 1. Различни степени на бъбречно увреждане при предразположен към инсулт SHR. A, Оцветяване с ематосилин-еозин от степен 0 (отсъствие на бъбречни лезии). B, оцветяване с ематосилин-еозин степен 1, разреждане на SMC и хиалиноза на съдовата стена (пунктирана стрелка) без признаци на паренхимно увреждане. C, оцветяване на Ematossilin-van Gieson от степен 2 на хиалиноза и некроза на артериоли (пунктирани стрелки) с фокално вторично тубулно увреждане (звездичка). D, оцветяване с ематосилин-еозин от степен 3 обширна некроза на артерии и артериоли с фокални инфаркти на гломерулите (права стрелка).

ТАБЛИЦА 1. Различни степени на съдови и паренхимни лезии, наблюдавани при кохортни бъбреци F2

Класирането на бъбречните лезии се извършва независимо от 2 бъбречни патолози. Нивото на съгласуваност, изразено като процент на съгласие между двамата наблюдатели, е 91% (140 от 154 проби). В останалите екземпляри резултатите бяха дадени след колегиална ревизия и съгласие.

Генотипизиране и анализ на връзката

Проведен е скрининг на случаен маркер за геном, като се използва панел от 274 SSLP, за които се вижда, че са полиморфни между 2-те родителски щама. 10 SSLP са получени от различни източници: маркери, идентифицирани като DxMghy, DxMity, и DxRaty бяха от Research Genetics Inc; тези, дефинирани като DxWoxy бяха от Института за хуманна генетика на Wellcome; и маркерите, разработени от публикувани последователности, се отчитат с тяхното име на GenBank locus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Всички маркери бяха анализирани чрез PCR и разтворени върху 7% полиакриламидни гелове, след публикувани протоколи. 7 Разработена е генетична карта за свързване с компютърния пакет MAPMAKER/EXP3.0. 11.

Връзката на маркерите за генотип със степента на бъбречно заболяване се определя, като се групират животни с тежка оценка, степен 2 и 3, на хистологични лезии, чрез таблица за извънредни ситуации 4Х3 и χ 2 тест с 6 df. Експериментално прагово ниво 12 за деклариране на връзката е изчислено от QTL картограф 13,14 от 1000 пермутации на всеки маркер за генотип спрямо фенотипа в популацията като цяло и при мъжете и жените поотделно. Съобщава се, че връзката е значима, ако χ 2 статистиката за маркер е по-голяма от критичната стойност при α = 0,05 и предполагаща, ако е по-голяма от критичната стойност при α = 0,10. 15

Статистически анализ

SBP се изразява като средна стойност ± SEM. Корелацията между SBP и степента на бъбречната патология беше оценена чрез изчисляване на ρ коефициента чрез тест на Spearman. Разликата в разпределението по пол на бъбречното заболяване в кохортата F2 се изчислява с χ 2 тест с 2 df.

Резултати

В края на диетичното лечение SBP е средно 188 ± 2,3 mm Hg при плъховете от кохортата F2 (189 ± 3,6 при мъжки плъхове; 187 ± 3,8 при женски плъхове). Анализът на корелацията между нивата на SBP и степента на бъбречно увреждане при това кръстосване не постигна нивото на значимост (ρ коефициент, 0.201; P= NS). Когато мъжки и женски плъхове бяха анализирани поотделно, не беше открита корелация в нито една група (ρ коефициент, 0,154; P= 0,302, за мъжки плъхове; ρ коефициент = 0,222; P= 0,134 за женски плъхове).

Честотите на бъбречни лезии в общата популация F2 са показани в Таблица 1. Лезии от степен 2 и 3 са наблюдавани по-често при мъжки, отколкото при женски плъхове (19,7% срещу 9,3%; χ 2 = 7,95, P= 0,01).

Проведен е скрининг на случаен маркер за геном, като се използва панел от 274 генетични маркера, полиморфни между двата родителски щама. Генетична карта на връзката със средно разстояние между маркерите от 7 kcM е генерирана за настоящия интеркос. Както е показано на Фигура 2, 2 области, центрирани върху маркер D1Rat238 върху хромозома 1 (χ 2 = 13,9) и при микросателитен маркер в инсулиноподобния растежен фактор рецептор свързващ протеин 4 (Rbp4g) ген на хромозома 10 (χ 2 = 20,9) са били значително свързани със степента на бъбречно увреждане (Таблица 2) в популацията като цяло, като алелите SHR и SHRSP оказват защитен ефект съответно на локуса D1Rat238 и на локуса Rbp4g (праг на експериментално ниво, χ 2 = 12,1, за α = 0,05). Два допълнителни локуса, а именно каликреин (х 2 = 10,5) върху хромозома 1 и анонимният маркер D4Mgh7 (х 2 = 11) върху хромозома 4, показват предполагаема връзка с бъбречно заболяване, като алелът SHR оказва защитен ефект (експериментално) прагово ниво, χ 2 = 10 за α = 0,10).

лезии

Фигура 2. Генетични карти на връзката на 2-те области на хромозоми 1 (вляво) и 10 (вдясно), където е установена значителна връзка със степента на бъбречните лезии. От дясната страна на всяка карта на връзката се отчитат χ 2 стойности за всеки отделен маркер.

ТАБЛИЦА 2. Маркерни локуси, показващи значителна връзка със степента на бъбречни съдови и паренхимни лезии в популацията F2 като цяло, D1 плъх238 и Rbp4g и само при мъже D16Mit2

Анализът на връзките, извършен върху мъжки и женски плъхове, идентифицира поотделно един локус на хромозома 16, D16Mit2, където алелът SHRSP е значително свързан с по-тежка степен на бъбречно заболяване (χ 2 = 13,8; експериментално прагово ниво за мъжки χ 2 = 12,2, за α = 0,05).

Хистопатологичната оценка на родителските щамове SHR и SHRSP показва силно значима разлика в развитието на бъбречни лезии по време на излагане на диета, позволяваща инсулт. По-подробно при SHR не са открити съдови или паренхимни лезии на бъбречни секции след 4 седмици или продължително излагане (> 12 седмици) на японската диета. SHRSP показва прогресивни и маркирани бъбречни хистопатологични лезии по време на излагане на диета в японски стил. След 4 седмици диета, SHRSP показва минимални до умерени лезии (степен 0,5 до 1), докато след 8 до 12 седмици се наблюдават по-тежки лезии (степени 1 до 3).

Дискусия

В настоящото проучване ние изследвахме генетичните фактори, лежащи в основата на съдови и паренхимни бъбречни увреждания в SHRSP, животински модел на генетично предаден инсулт, който също показва висока податливост към развитие на бъбречни лезии преди началото на цереброваскуларните лезии. 2 Възползвайки се от панел от полиморфни маркери между SHRSP и тясно свързания щам плъх SHR, 10 силно устойчиви на развитието на мозъчно-съдови, както и на бъбречни лезии, 1,2,6 проведохме проучване на косегрегация на генотип/фенотип в хибридна кохорта SHRSP/SHR F2.

Нашите резултати показват, че най-малко 2 области, центрирани в анонимен маркер, D1Rat238, върху хромозома 1 и в инсулиноподобния растежен фактор, свързващ протеин 4 (Rbp4g) върху хромозома 10, показват значителна връзка и противоположен ефект върху тежестта на бъбречно увреждане. По-специално, алелът SHR при маркера D1Rat238 и алелът SHRSP при локуса Rbp4g показват защитен ефект върху развитието на тежко съдово и паренхимно бъбречно увреждане. В нашия експериментален модел умерените до тежки бъбречни лезии се откриват по-често при мъжки, отколкото при женски плъхове. Когато бяха проведени отделни анализи на връзките при мъжки плъхове и женски плъхове, ние идентифицирахме допълнителен локус върху хромозома 16, D16Mit2, където алелът SHR оказа защитен ефект върху развитието на тежки бъбречни лезии само при мъжки плъхове.

Протеините, свързващи рецептора на серумен инсулиноподобен растежен фактор, са повишени при хронична бъбречна недостатъчност и са предложени като един от потенциалните медиатори на забавяне на растежа при засегнатите деца. 16 Всъщност те свързват инсулиноподобния растежен фактор с по-висок афинитет от самия рецептор, като по този начин потенциално намаляват неговите биологични ефекти. В експериментален модел на хронична уремия, експресията на Rbp4g се увеличава в бъбреците 16 и показва инхибиторен ефект върху растежния хрущял. 17 В нашия експериментален модел, алелът SHRSP в локуса Rbp4g упражнява защитен ефект върху развитието на тежки бъбречни лезии. Необходими са специфични изследвания на биологичната активност на мутантния ген, както и установяване на вродени линии, за да се потвърди хипотезата, че Rbp4g може да представлява кандидат ген за бъбречно увреждане в този експериментален модел.

Генетично предразположение към развитие на бъбречни лезии е описано в различни модели на плъхове. В хипертоничния плъх с качулка от кафяв, щам на плъх, при който се развива тежко бъбречно увреждане с лека хипертония, се съобщава за QTL на хромозома 1, за да се определи степента на бъбречно увреждане, независимо от кръвното налягане, 18 и висока чувствителност към бъбречни лезии се наблюдава при SHR, носещ сегмент от хромозома 1 от кафяви норвежки плъхове след индукция на контролирана степен на хипертония на сол на дезоксикортикостерон ацетат. 19 Съвсем наскоро бяха открити 3 QTL, които обясняват повишената екскреция на албумин в урината при мюнхенския плъх Wistar Fromter, модел на хронична нефропатия и лека хипертония. 20.

Нито един от тези QTL не се припокрива с областта на хромозома 1, свързана със степента на бъбречно увреждане, идентифицирана в настоящото проучване. От друга страна, тези несъответствия могат да бъдат обяснени с разликите в генетичния фон между щамовете, използвани за изследване, и/или плътността на генетичните карти на връзката, получени за всеки експериментален модел, и накрая, чрез дефиницията на целевия фенотип. Трябва да се отбележи, че в същия експериментален модел ние идентифицирахме на хромозома 1 един QTL, STR1, свързан с латентност към инсулт, 7 и един локус, D1Wox4, потенциално участващ в модулацията на ендотел-зависима вазорелаксация. 8 Взети заедно, тези наблюдения предполагат, че няколко области от хромозома 1 на плъхове могат да бъдат включени в определянето на податливостта към съдови увреждания в различни съдови легла в животинския модел SHRSP.

Настоящото разследване изследва генетичната основа на бъбречно увреждане при SHRSP, като използва като целеви фенотип съдови и свързани с тях паренхимни лезии в бъбреците. Резултат за бъбречно увреждане е получен преди това при мъжки плъхове SHR и SHRSP 2 и е възпроизведен в настоящото проучване. Въпреки че плъховете SHR нямат бъбречни лезии след 4 седмици диета и е малко вероятно да имат бъбречни лезии дори след продължително излагане на диета в японски стил, SHRSP показа минимална степен на бъбречни лезии след 4 седмици диета и прогресивно нарастване на тежките лезии от 2 и 3 степен след 8 и 12 седмици диета, често свързани с началото на инсулт. В настоящото проучване плъховете F2 са изследвани само след 4 седмици японска диета, когато честотата на инсулт и свързана с инсулт смърт е 1,8% в популацията F2. 7 Тези открития могат да обяснят ниския процент на наблюдаваните тежки бъбречни лезии от степен 2 и 3.

Въпреки че повишените нива на SBP, както и високият прием на сол са от съществено значение за развитието на цереброваскуларни и бъбречни лезии в SHRSP, 1,2,5,21 е установено генетично предразположение към развитие на бъбречно увреждане. 6 Всъщност, SHRSP бъбрек, трансплантиран при получатели на SHR, държан с висок прием на сол, е имал по-тежка степен на бъбречно увреждане, отколкото родният SHR бъбрек, което показва, че когато е изложен на същото ниво на кръвно налягане и диетичен режим, SHRSP бъбрекът е присъщо силно податлив на бъбречно увреждане. В съответствие с тези наблюдения, ние не открихме никаква връзка между нивата на SBP и степента на бъбречно увреждане при настоящото кръстосване. В действителност, SBP, основен объркващ фактор в съдовата патофизиология, не се разделя в интеркоса SHRSP/SHR F2. 7-9 Не можем да изключим обаче, че диастоличното кръвно налягане и/или средните стойности на артериалното налягане, които не са били оценени в настоящото проучване, могат да бъдат свързани със степента на бъбречно увреждане.

В заключение, настоящите резултати показват, че няколко генетични локуса допринасят за развитието на бъбречно увреждане в нашия експериментален модел. Изследването на генетични фактори, лежащи в основата на междинни фенотипове на заболяването, като бъбречно заболяване в SHRSP, може да бъде полезно за дисекция на генетични фактори, лежащи в основата на податливостта към съдови увреждания, и за пълно обяснение на оставащата генетична вариация в латентността на инсулта в този експериментален модел. 7 Предвид дискретния характер на целевия фенотип, анализиран в настоящото проучване, не могат да се направят заключения относно общия принос на генетичните фактори. 22.

Перспективи

Бъбречните лезии предшестват началото на инсулт в SHRSP и се предполага, че те могат да участват в патогенезата на инсулт, като по този начин представляват потенциален междинен фенотип. Междинните фенотипове са предложени като допълващи се фенотипове, за да се намали разстоянието между гените и сложните признаци. В този контекст дисекцията на генетичната основа на бъбречно увреждане в този щам на плъхове може да представлява един от експерименталните подходи за хвърляне на светлина върху сложността на съдовата патология в този експериментален модел, както и първата стъпка за изследване на специфичната генна функция в вродени щамове, носещи селективни SHR или SHRSP хромозомни области.

В по-обща перспектива, дисекцията на генетични фактори, участващи в определянето на увреждане на целевите органи по време на хипертония, може да помогне за по-нататъшно разбиране на естествената история и профилактика на сърдечно-съдови заболявания и за постигане на по-задълбочени познания за механизмите, свързани със сърдечно-съдовата хомеостаза.