Субекти

Поправка към тази статия е публикувана на 20 януари 2016 г.

Тази статия е актуализирана

Резюме

Преживните животни са важни източници на храна за хората и глобални емисии на парникови газове. Разграждането на фуражите и образуването на метан от преживни животни разчитат на метаболитните взаимодействия между микробите на червея и влияят върху производителността на преживните животни. Съставът на микробната общност на румена и камилата в предните черва е определен в 742 проби от 32 животински вида и 35 страни, за да се прецени дали това е повлияно от диетата, вида домакин или географията. Подобни бактерии и археи доминират в почти всички проби, докато протозойните съобщества са по-променливи. Доминиращите бактерии са слабо характеризирани, но метаногенните археи са по-известни и запазени по целия свят. Тази универсалност и ограниченото разнообразие биха могли да направят възможно смекчаването на емисиите на метан чрез разработване на стратегии, насочени към малкото доминиращи метаногени. Различията в състава на микробната общност се дължат предимно на диетата, като гостоприемникът е по-малко влиятелен. Имаше няколко силни модела на съвместна поява между микробите, което предполага, че основните метаболитни взаимодействия са по-скоро неселективни, отколкото специфични.

Въведение

Рубените микроби могат да бъдат причислени към различни функционални групи, като целулолитици, амилолитици, протеолитици и др., Които разграждат голямото разнообразие от фуражни компоненти или допълнително метаболизират някои от продуктите, образувани от други микроби 3. Например, метаногените, метанообразуващите археи, са сред тези, които метаболизират водорода, образуван от някои ферментативни микроби, за да образуват метан. Метанът, генериран по време на тази ферментация, допринася за глобалните антропогенни емисии на парникови газове 4 и представлява 2–12% загуба на фуражна енергия за животното 5. Различията в микробните съобщества на рубца са в основата на вариациите в образуването на метан 6 и превръщането на фуражите в животински продукти 7,8. Следователно разбирането на тези общности е от ключово значение за разбирането на трансформацията на растителните суровини в нежелани и полезни продукти от преживни животни.

Целта на това проучване е да се определи съставът на микробиотата в пробите от търбух и предни черва от 742 отделни животни от цял ​​свят. Полученият набор от данни ни позволи да определим, че диетичните фактори доминират над видовете гостоприемници при определяне на състава на микробната общност, да идентифицираме доминиращите микроби и техните потенциални асоциации и да опишем степента на сходство на микробните общности на търбуха по света.

Резултати и дискусия

Това е най-голямото едно изследване за изследване на микробни съобщества в редица видове преживни животни и камили, диети и географски региони. Стандартизиран тръбопровод е използван за обработка на проби, за да се сведе до минимум вариацията, въведена чрез етапи на обработка като екстракция на ДНК или PCR амплификация. Това е важно за откриване на автентични модели, а не на такива, въведени чрез методологични разлики между различните изследвания 9. Избраните праймери усилват, доколкото ни е известно до момента, целевите генни региони от почти всички известни бактерии, археи и реснички реснички.

Доминиращи микроби от рубци

микробната

Произход на пробите и техните бактериални и археални състави в различни региони.

Числата под кръговите диаграми представляват броя на пробите, за които са получени данни. Най-разпространените бактерии и археи са посочени по посока на часовниковата стрелка, започвайки от горната част на кръговата диаграма. Допълнителни подробности за пробите и състава на общността са дадени в допълнителни таблици 1, 2, 3 и 4 и допълнителни данни 1. Mmc. Метаномасиликокалес. Картата е получена от Wikimedia Commons (http://commons.wikimedia.org/wiki/File:BlankMap-World-v2.png,originaluploaderRoke,accessedMay2013). Кръговите диаграми са създадени в Microsoft Excel и съставното изображение, генерирано с Microsoft PowerPoint и Adobe Illustrator. https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.en

Проверката на най-разпространените и разпространени бактериални оперативни таксономични единици (OTU) в набора от данни показва, че само 14% попадат в посочен вид, а 70% дори не са в рамките на официално признат род (фиг. 2а). Когато в анализа бяха включени култивирани изолати от все още неназовани видове, доминиращите OTU бяха по-добри (35%), но все още слабо представени от култури, принадлежащи към потенциално същия вид (фиг. 2б). Това проучване показва, че макар да изглежда, че разпознаваме доминиращите бактерии от рубци, все още са необходими значителни микробиологични усилия за тяхното разбиране. Полагат се известни усилия за изолиране на повече култури и събиране на повече информация за тези бактерии 13,14. Например геномите на Превотела aff. руминикола Tc2-24, бактерията на рубца R-7 и други изолати, чиито 16S rRNA генни последователности са подобни на тези на доминиращите OTU на рубея (фиг. 2b), са секвенирани като част от проекта Hungate1000 15 .

Доминиращи бактериални и археални оперативни таксономични единици (OTU).

Прилики (допълнителни таблици 8 и 9) на 50-те най-разпространени и 50 най-разпространени бактерии (77 уникални OTU, (а, б) и археални (64 уникални OTU, c, d) OTU за най-тясно свързания тип (а, в) и култивирани (b, d) щамовете се нанасят заедно с данни за разпространението и изобилието. Засенчването на фона показва номинални прилики между видовете (тъмно сиво), вътре в рода (средно сиво) и под рода (светло сиво). Разпространението показва процента на пробите, в които се появява OTU. Размерът на всеки кръг показва средното изобилие на всеки OTU (допълнителни таблици 8 и 9). Изобилието на бактериални OTU се умножава по коефициент 15 спрямо археалните OTU. Mbb. Метанобревибактер.

Тъй като има течение както на течности, така и на твърди вещества през червея 16, микробите трябва активно да се метаболизират, за да получат енергия и да се размножават, за да противодействат на измиването и така да поддържат популациите в рубца 17. Следователно доминиращите бактерии, открити в това проучване, вероятно са отговорни за по-голямата част от трансформацията на погълнатите фуражи в червея и камилата в предната част на червата, особено на целулоза, хемицелулоза, пектин, нишесте, фруктан, органични киселини и протеини, тъй като това са основни енергийни субстрати, използвани за микробен растеж 17. Съществува също така сближаване на структурата на бактериалната общност в търбуха и в реколтата от хоацин, птица, която разчита на ферментация на предните черва на погълнатите листа 18. По този начин структурата на микробната общност изглежда се движи от сходството на функцията на органите, простиращо се през търбуха, камилното предно черво и реколтата от тази необичайна птица. Следва да се положат повече усилия за характеризиране на метаболизма и ролята на тези бактерии, които са отговорни за по-голямата част от ферментацията на фуражите, с цел повишаване на продуктивността на животните и намаляване на емисиите на метан.

Почти всички археи са идентифицирани като метаногени, за които се знае, че са обитатели на червея (Допълнителна таблица 3, Допълнителен текст 1) и относителното им изобилие е сравним с предишни проучвания 19. Преобладаващите археални групи бяха забележително сходни във всички региони на света (фиг. 1). Тази универсалност и ограничено многообразие също беше отбелязано наскоро при изследване на археите в новозеландските преживни животни 20 и би могло да направи възможно успешно смекчаване на емисиите на метан чрез разработване на стратегии, като ваксини или инхибитори на малки молекули, насочени към малкото доминиращи метаногени.

Ефекти от диетата и гостоприемника върху състава на микробната общност

Тъй като изобилието от микробни групи варира между групите животински видове и кохортите (допълнителни таблици 2 и 4; допълнителна фигура 2), ние потърсихме фактори, които биха могли да стоят в основата на това. Може да се очаква, че структурата на микробната общност на румен и камила предни черва ще бъде оформена от морфологични, физиологични и дори поведенчески характеристики, които са се развили заедно с разнообразните стратегии за хранене в различните родове преживни животни 2. Всъщност адаптацията е довела до разнообразие от размери на търбуха и скорост на преминаване на съдържанието на червеи, което позволява на преживните животни да използват редица видове фуражи. В допълнение към ефектите върху състава на фуражите 25, тези адаптации на гостоприемника могат също да играят роля в регулирането на структурата на микробната общност на рубея. Тъй като нашият набор от данни е от преживни животни и камили от различни родове, консумиращи редица диети, ефектите върху гостоприемника и диетата върху структурата на микробната общност на рубци могат да бъдат разделени.

Ефект на видовете гостоприемници и хранителните фуражи върху концентрацията на съотношенията върху микробните съобщества.

Диетите бяха групирани (допълнителна таблица 7) като доминиран фураж (F), смесен фуражен концентрат (50–70% фураж, FC), смесен концентрат-фураж (50–70% концентрат, CF) или доминиран концентрат (C ). (а) Дискриминантният анализ на микробните съобщества в пробите (представени от точки, оцветени от животни и диета) разкрива, че както домакинът, така и диетата определят състава на общността. (б) Би-сюжет, който показва микробни групи (идентифицирани по цветове), лежащи в основата на разделянето на пробите в панела (а). Няколко бактериални групи силно дискриминират пробите по гостоприемник и хранителен режим, посочени от тяхното присъствие към външната страна на би-сюжета. Археалните и протозойните групи са по-малко дискриминационни и така са групирани по-близо до центъра. (° С) Топлинната карта показва, че изобилието от бактерии е диференцирано свързано с диетата и гостоприемника (цветният ключ показва резултата от асоциацията; вж. Допълнителни фигури 3-5 за допълнителни данни) (д) Некласифициран Veillonellaceae и (д) Fibrobacter са примери за бактерии, които са причинили говедата и капридите да се групират отделно от другите видове в топлинната карта. Броят на пробите във всяка категория е даден в скоби в панели (c – e). * показва некласифицирани бактерии в рамките на поръчка или семейство.

Относителното изобилие на няколко основни бактериални групи се влияе както от гостоприемника, така и от диетата (фиг. 3в). Некласифициран Clostridiales са били най-много при говеда, хранени с фураж и най-малко в едър рогат добитък, хранени с висококонцентрирани диети, докато при капридите, сърните и камилите тези диетични разлики са били далеч по-слабо изразени. Бутиривибрио е най-много в проби от румени животни от говеда, смеси от фураж и концентрати. Fibrobacter е най-много в говеда, хранени с фураж. Когато концентратът е включен в диетата на говедата, относителното изобилие от Fibrobacter е намалена, но все пак е по-обилна, отколкото при други животни. За да разгледаме разпространението му по-подробно, сравнихме Fibrobacter изобилие в различни видове преживни животни и са установили значително по-високи нива в говеда в сравнение с елени, овце или камили (фиг. 3д). Тези данни предполагат това Fibrobacter е облагодетелстван в говеждия търбец и като се има предвид, че е разградител на целулоза 30, може да играе съществена роля за разграждането на растителните влакна при говедата.

Като цяло диетата беше основен фактор, определящ структурата на бактериалната общност. Това може да се дължи на това, че физическите и химичните характеристики на фуража определят различните налични микробни ниши. За разлика от пост-стомашния храносмилателен тракт на бозайници 31 и поради огромния обем на храносмилането и фуража, вероятно има по-малко оформяне на микробната общност на червея от местните биологични фактори гостоприемници като имунната система, секретираните антимикробни пептиди, гостоприемника клетъчно гликозилиране и хранителни вещества, получени от гостоприемника.

Асоциации между микробите на рубца

Асоциации между бактерии и археи.

Мрежата се основава на оценки на асоцииране, изчислени чрез регуларизиран каноничен корелационен анализ с абсолютна оценка на асоциация, по-голяма от 0,15. Цветът на линиите показва силата на асоциацията. Размерите на диамантите и кръговете показват средното средно изобилие, а микробните групи се идентифицират с числа (допълнителни таблици 1 и 3). Mbb. Метанобревибактер, Mmc. Метаномасиликокалес, * показва некласифицирани бактерии в семейството.

Резултатите от това проучване показаха, че микробната екосистема на рубея е доминирана от основна общност, съставена от зле характеризирани микроби, особено сред бактериите. Диетата има по-голямо влияние от животинските видове върху състава на микробната общност на червея или камилите. Екосистемите на румена се характеризират със силни метаболитни взаимодействия между микробите, които улесняват ферментацията на растителен материал до продукти, полезни както за гостоприемниците, така и за другите микроби на търбуха 3,17,25,32. Сравнително малкото съпътстващи модели, наблюдавани в това проучване, предполагат, че тези микробни взаимодействия не разчитат на изключителни асоциации и биха могли да посочат значителна размирица между членовете на взаимодействащите функционални групи. Анализът на метагеномно и метатранскриптомично ниво може в бъдеще да разкрие дали общи функционални елементи, които улесняват взаимодействията, се споделят между множество видове. Изглежда правдоподобно, че функционалната излишък сред микробите 9 означава, че множество микробни видове могат да изпълняват една и съща функция, като различни комбинации от микроби се избират съвместно в зависимост от диетата. Тази гъвкавост на структурата на микробната общност на рубци би предоставила на преживните животни способността да експлоатира разнообразие от различни растителни фуражи.

Методи

Географско разпределение и разнообразие от проби със съдържание на стомашно-чревния тракт

Общо 742 проби от 32 вида или подвида преживни животни и други ферментатори на предните черва в 35 страни и седем глобални региона бяха избрани за секвениране на гени на микробни маркери (фиг. 1, допълнителни данни 1). Пробите са от говеда, бизони и биволи (едър рогат добитък), овце и кози (каприди), елени (сърни) и алпаки, лами и гуанако (камили), включително различни породи домашни говеда, овце и кози и в голяма степен са съставени от малки кохорти от четири или повече лица, разположени съвместно, консумиращи една и съща диета. В това проучване включихме проби от предни черва на камили, признавайки, че тези органи имат обща функция, но са се развили отделно 39. Използването на животни, включително хуманно отношение, отглеждане, експериментални процедури и събиране на проби, използвани за това проучване, беше одобрено, когато е приложимо, от посочените институционални и/или лицензионни комисии и извършено в съответствие с одобрени институционални и регулаторни насоки (моля, вижте Допълнителни данни 1 за подробности за тях).

Вземане на проби, екстракция на ДНК, амплификация и обработка на проби за последователност с висока производителност

Филогенетичен анализ на данни за секвениране

Данните за пиросеквенцията бяха обработени и анализирани с помощта на софтуерния пакет QIIME версия 1.8 43. Поредици с дължина над 400 bp със среден качествен рейтинг над 25 бяха присвоени на конкретна проба чрез баркодовете. Броят на наличните за анализ четения на последователности от протозойни протоколи от бактерии, археи и реснички са обобщени в допълнителни данни 1. Данните от последователността са групирани в оперативни таксономични единици (OTU), споделящи над 97% (бактерии - UCLUST 44), 99% (археи - UCLUST) или 100% (ресничести протозои - опция prefix_suffix в QIIME) сходство на последователността. Последователностите бяха присвоени на филогенетични групи от BLAST 45. Бактериални 16S рРНК гени бяха присвоени с помощта на базата данни Greengenes версия 13_5 10, гени 16S рРНК на археи, използващи RIM-DB версия 13_11_13 22 и ресничести протозойни 18S рРНК гени срещу вътрешна база данни 46. Данните за бактериални и ресничести протозои са обобщени на ниво род. Археите са обобщени на видово ниво. Проби, за които са получени ниски отчетени числа или които съдържат високи пропорции на последователности от „екзогенни“ бактерии (т.е. вероятни замърсители на околната среда като Stenotrophomonas) бяха изключени от допълнителни анализи (допълнителен текст 1).

Идентичността на най-разпространените и преобладаващи OTUs беше определена с помощта на BLAST 45 срещу последователности от материал тип и срещу всички последователности (с изключение на последователности от моделни организми или проби от околната среда) в базата данни nt 47. Bellerophon (версия 3, прозорец с 200 bp, корекция на Huber-Hugenholtz 48) е използван за идентифициране на химерни OTU последователности. Сходствата на последователностите, по-големи от 97% и 93%, бяха използвани като гранични стойности за класифициране на OTU, съответно на ниво вид и род. Обосновката за тези прекъсвания беше обсъдена от Kenters и др. 49 .

Опростена класификация на хранителната информация и други фактори

Диапазонът на диетите, консумирани от животните, от които са взети пробите, е много разнообразен и сложен. Поради тази причина и когато информацията е била достъпна, хранителните режими са категоризирани по отношение на вида фураж, фуражната растителност и съотношението фураж към концентрат (допълнителна таблица 7). Диети, които вероятно съдържат> 5% нишесте (напр. Цели или зърнени култури от царевица, ечемик, пшеница, ориз, както и грах, картофи, сорго и др.) Или> 5% пектин (например цвекло или бобови растения като люцерна и детелина) също са идентифицирани. Животните, които са били хранени със съответната си диета за по-малко от две седмици, са отбелязани в допълнителни данни 1. Фактори като пол, възраст, модификации (напр. Канюлация), лечение (напр. Антибиотици, овлажняване, хирургия), условия на отглеждане, сезон, контакт с други животни и стъпки за обработка на проби, които могат да повлияят на очевидните микробни състави на общността (напр. метод на екстракция на ДНК, използвана фракция на пробата, съхранение на проби и т.н.) също са записани (допълнителни данни 1). Където не бяха предоставени подробности, географската ширина, дължина и надморска височина бяха оценени чрез http://www.mapcoordinates.net/en. Климатичните зони бяха определени съгласно схемата за класификация на климата Köppen-Geiger 50 .

статистически анализи

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Хендерсън, Дж. и др. Съставът на микробната общност на румена варира в зависимост от диетата и гостоприемника, но основен микробиом се среща в широк географски диапазон. Sci. Представител. 5, 14567; doi: 10.1038/srep14567 (2015).