• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за Стивън О’Рахили
  • За кореспонденция: so104 @ medschl.cam.ac.ukapc36 @ cam.ac.uk

Принос от Стивън О'Рахи, 17 юли 2017 г. (изпратено за преглед на 3 май 2017 г .; прегледано от Йенс Брунинг и Марсело А. Нобрега)

роля

Значимост

Нарастващият размер и сложността на проучванията за асоцииране в целия геном доведоха до идентифицирането на варианти, които са ясно и надеждно свързани със затлъстяването. Силна връзка между повишен ИТМ и регион на човешка хромозома 2, близо до гена TMEM18, е многократно демонстрирана при деца и възрастни. Функцията на TMEM18 в контрола на апетитното поведение и телесния състав е слабо характеризирана. При миши модели показваме, че загубата на зародишна линия води до увеличаване на теглото, докато свръхекспресията при хипоталамус при възрастни води до загуба на тегло, подкрепяйки хипотезата, че TMEM18, действащ в централната нервна система, може да повлияе на енергийния баланс. Ние също така докладваме структура и предполагаема молекулярна функция на TMEM18, предизвикваща настоящия публикуван модел.

Резюме

Интергенен регион на човешка хромозома 2 (2р25.3) съдържа генетични варианти, които са сред най-силно и възпроизводимо свързани със затлъстяването. Най-близкият до тези варианти ген е TMEM18, въпреки че молекулярните механизми, медииращи тези ефекти, остават напълно неизвестни. Експресията на Tmem18 в мишото хипоталамусно паравентрикуларно ядро ​​(PVN) е променена от промени в хранителното състояние. Загубата на зародишна линия на Tmem18 при мишки води до повишено телесно тегло, което се влошава от диетата с високо съдържание на мазнини и се дължи на увеличения прием на храна. Селективната свръхекспресия на Tmem18 в PVN на мишки от див тип намалява приема на храна и също увеличава енергийните разходи. Ние предоставяме доказателства, че TMEM18 има четири, а не три трансмембранни домена и че физически взаимодейства с ключови компоненти на ядрения порен комплекс. Нашите данни подкрепят хипотезата, че самата TMEM18, действаща в централната нервна система, е правдоподобен медиатор на въздействието на съседни генетични вариации върху човешкото затлъстяване.

Резултати

Tmem18 се експресира в хипоталамусното паравентрикуларно ядро.

Топология на протеина TMEM18. Показано е свръхекспресията на N-крайния FLAG-маркиран TMEM18 в COS клетки, третирани или с TX-100 (пермеабилизира както плазмата, така и с ядрената мембрана) или дигитонин (само пермеабилизира плазмената мембрана). Експресията на TMEM18 се открива или с FLAG антитяло (червено, A и B), или с антитяло към С-края на TMEM18 (зелено, C и D).

TMEM18 е малко вероятно директно да регулира транскрипцията.

Предполага се, че TMEM18 свързва ДНК и потиска транскрипцията (20). За да проверим тази хипотеза, направихме RNA-Seq анализ на хипоталами от див тип и Tmem18 нокаутиращи мъжки мишки (ENA присъединителен номер PRJEB13884). Общо 27 691 (27 727 с ненулев общ брой на четенията; 36 отклонения на готвач Cutoff; реф. 25) анотираните гени са имали четения, картографирани в поне една проба и са били използвани за анализ на диференциална експресия (среден брой уникално картографирани четения на проба: 32,4 × 10 −6 ± 2,04 × 10 −6 SD). Интересното е, че след корекция за многократно тестване, само Tmem18 беше значително диференцирано експресиран в рамките на хипоталамите на двата генотипа (padj = 3,02 × 10–22; SI Приложение, Фиг. S12A). qRT-PCR анализът на Tmem18 и шест допълнителни гена с най-малки (но не статистически значими) стойности на padj потвърждават данните за RNAseq (приложение SI, фиг. S12B), което предполага, че TMEM18 е малко вероятно да бъде глобален регулатор на транскрипцията, както се съобщава (20).

TMEM18 взаимодейства с два ядрени белтъка, NDC1 и AAAS.

BiFC и съвместно IP потвърждение на взаимодействието TMEM18 с NDC1 и AAAS. (A – G) Физическото взаимодействие между TMEM18 и NDC1, и AAAS беше потвърдено от BiFC. N-краят на YFP е слят с маркиран с FLAG NDC1 (YN-F-NDC1; C) или AAAS (YN-F-AAAS; E) или NUP35 (отрицателен контрол, YN-F-NUP35; G), докато C крайната точка на YFP се слива с TMEM18 (TMEM18-Yc). Експресията на FLAG беше открита чрез използване на FLAG антитяло (червено), докато YFP сигналът е изобразен в зелено. YN-F-NDC1 и AAAS-YC се използват като положителна BiFC контрола (B). (H и I) Експерименти с коимунопреципитация, използващи маркирани с FLAG TMEM18 и GFP-маркирани NDC1 (H) или AAAS (I) свръхекспресирани в HEK клетки. Прекъснатите линии в петно ​​представляват две различни ленти в едно и също петно, взети заедно.

Дискусия

Мъжки мишки с HFD напълняват поради увеличен енергиен прием. За отбелязване е, че данните от индиректната калориметрия показват също така, че нулевите мишки Tmem18 имат ∼10% увеличение на енергийните разходи в сравнение с мишки от див тип, но тъй като приемът на храна е увеличен с ∼30%, доминиращият стремеж е към излишък на калории и наддаване на тегло . Това може да се разглежда като пример за „термогенеза, индуцирана от диета“, състояние, разглеждано като ефект от промяна към по-калорична диета, при която мишките увеличават едновременно енергийните разходи и приема на храна (33). Потенциалната биологична цел и тъканите, свързани с това явление, продължават да се оспорват (34). Съществува повече съгласие, че температурата на околната среда на дадено проучване може да има силно качествен ефект върху резултата от метаболитните изследвания (35). Нашите проучвания бяха проведени при „стандартни“ условия за домашни животни, което може да се счита за хроничен термичен стрес за мишките. Бъдещите изследвания на енергийните разходи при мишки с дефицит на Tmem18, живеещи при термонеутралност, могат да бъдат полезни за по-нататъшното разбиране на ролята на тази молекула в метаболитния контрол.

Няколко групи по-рано са показали, че Tmem18 е силно експресиран в хипоталамуса, въпреки че не всички са съобщили, че той е хранително регулиран (19, 36, 37). Нашите данни също показват, че Tmem18 се експресира в редица хипоталамусни области. Избрахме да се съсредоточим върху PVN, анатомична област, обогатена с невронални популации, участващи в апетитно поведение и разход на енергия (38) и в която видяхме хранителна регулация. Остава да се определи характерът на експресиращите Tmem18 неврони в PVN. Освен това, естеството на различните смущения (загуба на зародишна линия в Tmem18 tm1a спрямо доставяне на AAV чрез стереотаксична инжекция) вероятно означава, че популацията на PVN невроните, загубила експресията на Tmem18 при нулевите мишки, може да не е същата популация, която е получила свръхекспресия в проучването AAV, управлявано от стереотаксика. За съжаление бяхме неуспешни в опитите си да използваме siRNA и Cre за селективно нокаутиране и/или изтриване на Tmem18 в PVN въпреки обещаващите предварителни проучвания in vitro. В бъдеще трансгенните линии със специфични анатомични Cre драйвери (напр. Sim1-Cre, Agrp-Cre) могат да бъдат полезни за допълнително очертаване на ролята на TMEM18 както в ядрата на хипоталамуса, така и в специфични невронални популации.

Методи

Подробни методи за изследване са предоставени в приложението SI, Методи SI.

Животни.

Всички процедури бяха извършени в съответствие с насоките на Министерството на вътрешните работи на Обединеното кралство. Животните бяха държани при контролирана температура (22 ° C) и 12-часов светъл, 12-часов тъмен график (светлини на 700–1900).