История на публикациите

Изгледи на статии
Altmetric
Цитати

Прегледите на статиите са съвместими с COUNTER сбор от пълни текстови изтегляния на статии от ноември 2008 г. (както PDF, така и HTML) във всички институции и лица. Тези показатели се актуализират редовно, за да отразят употребата, водеща до последните няколко дни.

Цитиранията са броят на други статии, цитиращи тази статия, изчислен от Crossref и актуализиран ежедневно. Намерете повече информация за броя на цитиранията в Crossref.

Altmetric Attention Score е количествена мярка за вниманието, което една научна статия е получила онлайн. Кликването върху иконата на поничка ще зареди страница на altmetric.com с допълнителни подробности за резултата и присъствието в социалните медии за дадената статия. Намерете повече информация за оценката на Altmetric внимание и как се изчислява резултатът.

второ

Резюме

Фосфорилирането на протеиновото хистидин играе решаваща роля в клетъчната сигнализация и централния метаболизъм. Детайлните му функции обаче остават неуловими поради технически предизвикателства при откриване и изолиране на протеини, носещи фосфохистидин (pHis), лабилна посттранслационна модификация (PTM). За да се справим с този проблем, преди това разработихме първите pHis-специфични антитела, използвайки стабилни, синтетични аналози на pHis на базата на триазол. Понастоящем се съобщава за второ поколение, базиран на пиразол pHis аналог, който позволи развитието на pan-pHis антитяло с много подобрена pHis специфичност.

Протеиновото фосфорилиране е широко проучена пост-транслационна модификация (PTM). Аберантното клетъчно сигнализиране, включващо този PTM, е свързано с много човешки заболявания, включително рак. (1) Докато фосфорилирането може да възникне върху различни странични вериги на нуклеофилни аминокиселини, светлината на прожекторите се фокусира основно върху фосфоестерите на серин (pSer), треонин (pThr), и тирозин (pTyr).

За разлика от огромните знания, натрупани за pSer, pThr и pTyr, химията и биологията на н-фосфорилираните аминокиселини като фосфохистидин (pHis), фосфоаргинин (pArg) и фосфолизин (pLys) остават недостатъчно проучени., (3) и доказателства за участието му в епигенетиката, (4) Сигнализирането за G протеини, (5) и йонната проводимост (6) също се появяват.

Въпреки нарастващата оценка за различните роли на pHis в биологията, остават значителни препятствия, които възпрепятстват проучванията в тази област, а именно (1) присъщата нестабилност (7) на pHis връзката при киселинните условия, които често се използват в биохимичните и фосфопротеомичните работни процеси (8) и (2) липса на изследователски инструменти, насочени към откриване и анализ на рН в биологичните проби.

В опит да се справим с тези аналитични недостатъци, наскоро разработихме първите пан- и последователности специфични антитела pHis. (9) Нашият успех зависи от използването на нехидролизуеми синтетични аналози на pHis като хаптени, стратегия, която преодолява in vivo разлагането проблеми, които изключват използването на нативния PTM при генериране на антитела.2) и pTze (3) са предназначени да имитират структурата и електрониката на pHis (1), докато замества химически лабилната връзка на фосфорамидат с по-стабилен фосфонат (Фигура 1). Следователно, тези синтетични хаптени предизвикаха успешно имунни отговори у животните гостоприемници за генериране на антитела, които също така реагираха кръстосано с естествени pH протеини.

Докато аналозите на базата на триазол са предоставили полезни рН-специфични антитела, тези реагенти имат няколко недостатъка. Първо, антителата, получени при използване на тези аналози на pHis от първо поколение, имат малко по-нисък афинитет към естественото pHis в сравнение със самия аналог. Второ и може би по-важното е, че антителата имат лека кръстосана реактивност към pTyr, (9b), потенциално ограничавайки приложенията в биологията на бозайници, където pTyr-носещите протеини могат да предизвикат силни фонови сигнали.

Тези наблюдения предполагат, че нашият оригинален аналог на pHis, базиран на триазол, не е перфектна имитация на естествено pHis, което ни кара да разглеждаме използването на други аналози като потенциални хаптени. Съответно се обърнахме към рН на базата на пиразол е аналог, pPye (фосфоно-пиразолил етиламин, 4 (Фигура 1)). (10) Пиразоловото ядро ​​на pPye запазва C-H групата, намерена в позицията C2 в pH, докато азотен атом присъства в тази позиция в pTza и pTze. DFT изчисленията (11) (Фигура 1) показват, че допълнителният азот в аналозите на триазола води до фини разлики във формата (C – H срещу N самотна двойка) и електрониката (повече поляризация в триазола). Освен това е известно, че пиразолил фосфонатите имат рКстойности от 1,8 и 6,7 (12) и, следователно, трябва да са предимно в дианионна форма, като pHis, при физиологично pH. (7) Въз основа на тези съображения очаквахме, че pPye ще бъде добра имитация на pHis.

Фигура 1

Фигура 1. Фосфохистидин (pHis, 1) и неговите стабилни аналози. Представена е структурата и изчислената електростатична карта на групите глави (цветни).

С този дизайн в ръка, pPye беше подготвен от лесно достъпни материали. Известният фосфонопиразол (13)5 е алкилиран с търговски наличен бромид 6. Последващото глобално премахване на защитата с HBr в оцетна киселина даде pPye (4) с добър добив (Схема 1). Използвайки рН-зависими измервания на химически отмествания, ние потвърдихме, че фосфорилната група в 4 е в дианионно състояние при физиологично рН, подобно на естественото рН е (допълнителна фигура 1).

Схема 1

pPye се конюгира чрез своята първична аминна група с протеина-носител, хемоцианинът на лимфен отвор (KLH) и се използва като имуноген за генериране на антитела при зайци. След това антителата, свързващи pHis от заешкия антисерум, бяха пречистени по афинитет през имобилизиран pHis-говежди серумен албумин (BSA-pHis) (допълнителна фигура 2). Тези афинитетно пречистени антитела бяха тествани за рН специфичност спрямо други типове фосфо-аминокиселини чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (Фигура 2). Получените от pPye антитела показват много по-висок афинитет на свързване към BSA-pH е над BSA или BSA конюгатите на други фосфоаминокиселини. Забележително е, че новите антитела показват значително подобрена специфичност за рН над pTyr в сравнение с нашето първо поколение, получено от pTze антитяло (Ab 1.0) (Фигура 2). Освен това, полученото от pPye антитяло показва дори по-добра селективност спрямо pSer или pThr, отколкото търговското pan-pTyr антитяло (4G10) (Фигура 2). Дот-блот тестовете, използващи синтетични фосфопептиди, също показват подобрена селективност на антителата, получени от pPye, в сравнение с Ab 1.0 (допълнителна фигура 3).

Фигура 2

Фигура 2. ELISA анализ на pPye-получено pHis антитяло, първо поколение pTze-получено pHis антитяло (Ab 1.0) и pTyr антитяло (4G10) срещу BSA, BSA-pHis, BSA-pTyr, BSA-pSer, BSA-pThr, и BSA-pPye субстрати (н = 4; ± s.d).

За да проверим дали получените от pPye антитела pHis са независими от последователността, извършихме Western blot анализ върху поредица от известни pHis протеини (Фигура 3). Тези протеини са или ензимно фосфорилирани (фосфоглицерат мутаза 1 (PGAM1) и фосфоенолпируват протеин фосфотрансфераза (PtsI)) или химически фосфорилирани (хистон Н4) селективно върху хистидин. Тъй като има два хистидинови места в нативния хистон H4, които могат да бъдат химически фосфорилирани (His-18 и His-75), като по този начин се обърква способността ни да се изследва специфичността на последователността на антитялото, ние използвахме един хистидин, съдържащ хистон H4, където His-75 мястото мутира до аланин (хистон H4 H75A). Радостно е, че всички протеини, които тествахме, показаха силни сигнали, когато те бяха фосфорилирани върху хистидина, докато нефосфорилираните протеини не (Фигура 3а). Освен това, добавянето на хидроксиламин към фосфорилираните протеини, което води до селективно дефосфорилиране на рН, води до загуба на откриване чрез Western blot. Пептидните последователности около местата на pHis показват разнообразие по отношение на заряда и хидрофобността, подкрепяйки идеята, че антитялото наистина е независимо от последователността (Фигура 3b).

Фигура 3

Фигура 3. (а) Western blot анализ на инвитро фосфорилирани протеини. Лявият панел показва Western blot, използвайки антитялото, получено от pPye, а десният панел е петно ​​на Coomassie на мембраната, което служи за контрол на натоварването. Обърнете внимание, че димерната лента (~ 22 kDa), наблюдавана за Histone H4, вероятно се дължи на агрегиране (вж. Поддържаща информация). (b) Аминокиселинни последователности около pHis местата.

В обобщение, ние успешно разработихме второ поколение pan-pHis антитела. Това беше възможно благодарение на молекулярния дизайн и синтеза на pPye, базиран на пиразол стабилен pH, е аналог, който, както показваме, служи като ефективен хаптен за генериране на антитела. Важно е, че това ново антитяло се отличава с подобрена pHis специфичност спрямо pTyr и висок афинитет към pHis протеини по независим от последователността начин. Предвид нарастващия интерес към ролята на pHis-носещите протеини в биологията на бозайниците, включително метаболизма на рака (14), очакваме това антитяло да бъде ценно допълнение към арсенала от изследователски инструменти за фосфорилиране на хистидин. Усилията за изследване на ролята на фосфорилирането на хистидина в биологията на бозайниците са в ход.

подкрепяща информация

Представени са допълнителни фигури, експериментални процедури и данни за характеризиране. Този материал е достъпен безплатно чрез Интернет на адрес http://pubs.acs.org.

Правила и условия

Файловете с електронна поддържаща информация са достъпни без абонамент за ACS Web Editions. Американското химическо дружество притежава право на собственост върху авторски права върху всякаква поддържаща информация, защитена с авторски права. Файловете, достъпни от уебсайта на ACS, могат да бъдат изтеглени само за лична употреба. Потребителите нямат право по друг начин да възпроизвеждат, преиздават, разпространяват или продават каквато и да било поддържаща информация от уебсайта на ACS, изцяло или частично, под формата на машинно четене или друга форма без разрешение от Американското химическо общество. За разрешение за възпроизвеждане, повторно публикуване и разпространение на този материал заявителите трябва да обработят собствените си заявки чрез системата за разрешения на RightsLink. Информация за това как да използвате системата за разрешения RightsLink може да бъде намерена на адрес http://pubs.acs.org/page/copyright/permissions.html.

Информация за автора

J.-M.K. и R.C.O. допринесе еднакво.

Авторите не декларират конкурентен финансов интерес.

Признание

Тази работа е финансирана от Националните здравни институти на САЩ (5R01GM095880). R.C.O. и J.-M.K. бяха подкрепени от докторантски стипендии от Националния институт по здравни изследвания (1F32CA167901) и Фондация за изследване на рака Деймън Рунън (DRG-2005-09), съответно.

Препратки

Тази статия се позовава на 14 други публикации.

За свързан пример вижте:

Използван е софтуерен пакет Spartan ′08.

Цитирано от

Тази статия е цитирана от 24 публикации.

Резюме

Фигура 1

Фигура 1. Фосфохистидин (pHis, 1) и неговите стабилни аналози. Представена е структурата и изчислената електростатична карта на групите глави (цветни).

Схема 1

Фигура 2

Фигура 2. ELISA анализ на pPye-получено pHis антитяло, първо поколение pTze-получено pHis антитяло (Ab 1.0) и pTyr антитяло (4G10) срещу BSA, BSA-pHis, BSA-pTyr, BSA-pSer, BSA-pThr, и BSA-pPye субстрати (н = 4; ± s.d).

Фигура 3

Фигура 3. (а) Western blot анализ на инвитро фосфорилирани протеини. Лявият панел показва Western blot, използвайки антитялото, получено от pPye, а десният панел е петно ​​на Coomassie на мембраната, което служи за контрол на натоварването. Обърнете внимание, че димерната лента (~ 22 kDa), наблюдавана за Histone H4, вероятно се дължи на агрегиране (вж. Поддържаща информация). (b) Аминокиселинни последователности около pHis местата.