Допринесе еднакво за тази работа с: Ryoko Takei, Tomoaki Inoue

затлъстяване

Роли Куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, администриране на проекти, валидиране, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отдел по медицина и биорегулаторни науки, Висше училище по медицински науки, Университет Кюшу, Фукуока, Япония, Център за подкрепа за промоция на здравето на град Фукуока, Фукуока, Япония

Допринесе еднакво за тази работа с: Ryoko Takei, Tomoaki Inoue

Роли Куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, администриране на проекти, софтуер, валидиране, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отделение по медицина и биорегулаторни науки, Висше училище по медицински науки, Университет Кюшу, Фукуока, Япония

Надзор на ролите, валидиране

Отделение по медицина и биорегулаторни науки, Висше училище по медицински науки, Университет Кюшу, Фукуока, Япония

Роли Куриране на данни, методология, валидиране

Отделение по медицина и биорегулаторни науки, Висше училище по медицински науки, Университет Кюшу, Фукуока, Япония

Роли Куриране на данни, Администриране на проекти, Валидиране

Отделение по медицина и биорегулаторни науки, Висше училище по медицински науки, Университет Кюшу, Фукуока, Япония

Роли Куриране на данни, Проверка

Отделение по медицина и биорегулаторни науки, Висше училище по медицински науки, Университет Кюшу, Фукуока, Япония

Концептуализация на роли, придобиване на финансиране, администриране на проекти, ресурси, надзор, валидиране, визуализация, писане - преглед и редактиране

Присъединяване Градски център за подкрепа на промоцията на здравето в Фукуока, Фукуока, Япония

Роли Концептуализация, куриране на данни, придобиване на финансиране, администриране на проекти, ресурси, надзор, валидиране

Отдел по медицина и биорегулаторни науки, Висше училище по медицински науки, Университет Кюшу, Фукуока, Япония, Катедра по молекулярен и клетъчен метаболизъм, Висше училище по медицински и дентални науки, Токийски медицински и дентален университет, Токио, Япония

  • Риоко Такей,
  • Томоаки Иноуе,
  • Нориуки Сонода,
  • Мотоюки Кохджима,
  • Мисато Окамото,
  • Рюичи Сакамото,
  • Тойоши Иногучи,
  • Йошихиро Огава

Фигури

Резюме

Обективен

Въпреки че предишни проучвания съобщават за отрицателна връзка между серумната концентрация на билирубин и развитието на захарен диабет (DM), връзката между билирубина и инсулиновата резистентност не е напълно оценена. Това проучване е предназначено да определи връзките между билирубина, разпределението на телесните мазнини и възпалението на мастната тъкан при пациенти със ЗД тип 2 и ефекта на билирубина при модел на затлъстели животни.

Метод

Разпределението на телесните мазнини се измерва с помощта на коремен двоен биоелектричен импедансен анализатор при пациенти с тип 2 DM. Измерихме също гликемичен контрол, липиден профил, серумна концентрация на билирубин и други клинични характеристики и определихме връзката им с разпределението на телесните мазнини. В проучването с животни биливердин (20 mg/kg дневно) се прилага перорално на диети с високо съдържание на мазнини (HFD), индуцирани със затлъстяване (DIO) в продължение на 2 седмици, след което се извършва интраперитонеално тестване на инсулинов толеранс. След това площта на адипоцитите, експресията на адипоцитокин и поляризацията на макрофагите бяха оценени в мастните тъкани на епидидима.

Резултати

В клиничното проучване едномерният анализ показа, че по-ниската концентрация на билирубин е в значителна корелация с по-високия индекс на телесна маса, обиколката на талията, триглицеридите, пикочната киселина, креатинин, висцералната мастна област и по-ниския HDL-C. При многовариантните анализи концентрацията на билирубин значително корелира с диастолното кръвно налягане, креатинин и висцералната мастна област. Няма обаче връзка между концентрацията на билирубин и площта на подкожната мастна тъкан. В проучването с животни, DIO мишките, лекувани с биливердин, са имали по-малки адипоцити от нелекуваните DIO мишки и биливердинът подобрява индуцираната от HFD инсулинова резистентност. Лечението с Biliverdin обърна по-високата генна експресия на Cd11c, кодираща M1 макрофагичен маркер и Tnfa, кодиращ проинфламаторния фактор на некроза на туморен цитокинов тумор в мастните тъкани на DIO мишки. Тези данни предполагат, че приложението на биливердин облекчава инсулиновата резистентност чрез подобряване на възпалението и нарушаването на експресията на адипоцитокин в мастните тъкани на DIO мишки.

Заключения

Билирубинът може да предпази от инсулинова резистентност чрез подобряване на висцералното затлъстяване и възпалението на мастната тъкан.

Цитат: Takei R, Inoue T, Sonoda N, Kohjima M, Okamoto M, Sakamoto R, et al. (2019) Билирубин намалява висцералното затлъстяване и инсулиновата резистентност чрез потискане на възпалителните цитокини. PLoS ONE 14 (10): e0223302. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223302

Редактор: Макото Канзаки, Университет Тохоку, ЯПОНИЯ

Получено: 25 юни 2019 г .; Прието: 18 септември 2019 г .; Публикувано: 2 октомври 2019 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни се намират в ръкописа и в неговите поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа беше подпомогната отчасти от Специалните координационни фондове за насърчаване на науката и технологиите (Програма за финансиране на SCF „Иновационен център за медицинска редокс навигация“). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Не е получено допълнително външно финансиране за това проучване.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Материали и методи

Клинично проучване

Ние записахме 176 японски пациенти (90 мъже и 86 жени) със захарен диабет тип 2, които бяха приети в метаболитното отделение на Университетската болница в Кюшу между юни 2017 г. и декември 2018 г. Диагнозата захарен диабет беше потвърдена, използвайки критериите на Американската диабетна асоциация/Световната здравна организация (ADA/СЗО), или чрез потвърждаване на медицинска история на диабета. Клиничното проучване е проведено в съответствие с Декларацията от Хелзинки и одобрено от Комитета по клинична етика на университетската болница Кюшу (№ 29–33). Писмено информирано съгласие беше получено от всеки пациент. Пациенти, подложени на терапия за хроничен хепатит, чернодробна цироза или рак на черния дроб, които са имали анамнеза за рак на черния дроб, които са имали концентрации на серумна аспартат аминотрансфераза (AST) или аланин аминотрансфераза (ALT) над три пъти горната граница на нормалното ( > 120 U/L), или които са имали серумна обща концентрация на билирубин> 3.0 mg/dL, са били изключени.

Всички пациенти са подложени на клинична оценка и лабораторна оценка. Индексът на телесна маса (BMI) се изчислява като телесна маса (kg), разделена на квадрат на височина (m 2). Обиколката на талията (WC) беше измерена в средната точка между горния край на илиачния гребен и долния край на 12-то ребро, в края на нормалното издишване на всеки субект, с помощта на антропометрична лента. Висцералната мастна област (VFA) и подкожната мастна област (SFA) бяха измерени с помощта на коремен двоен биоелектричен импедансен анализатор (Dualscan HDS-2000; Omron Healthcare Co., Киото, Япония). Измервани са концентрациите на плазмена глюкоза на гладно, HbA1c (Национална програма за стандартизация на гликохемоглобина), общ холестерол (TC), липопротеин-холестерол с висока плътност (HDL-C), триглицериди (TG), пикочна киселина (UA), билирубин и креатинин . Нивата на HbA1c (%) бяха превърнати в единици mmol/mol на Международната федерация по клинична химия и лабораторна медицина с помощта на NGSP конвертора за HbA1c (http://www.ngsp.org/convert1.asp).

Изследване на животни

Животни и експериментален протокол.

Пет седмични мъжки мишки C57Bl/6J са закупени от Clea Japan Inc. (Токио, Япония). Мишките бяха настанени в клетки на колонии под 12-часов светлинен/12-часов тъмен цикъл, със свободен достъп до чешмяна вода и чау (Clea Japan Inc.). На 8-седмична възраст те започват да консумират или контролна диета (CD; 74% въглехидрати, 14% протеини и 12% мазнини) или HFD (20% въглехидрати, 18% протеини и 62% мазнини) в продължение на 8 седмици. На 16-седмична възраст половината от мишките, хранени с HFD (n = 16) или CD (n = 16), са избрани на случаен принцип, за да преминат към диета на прах (Clea Japan Inc.), допълнена с биливердин (20 mg/kg) (Frontier Scientific, Logan, UT, USA) в продължение на 2 седмици, докато останалите мишки консумират контролна диета на прах, която не съдържа биливердин, за същия период от време (S1 Фиг.), Както е описано по-рано [15]. Всички протоколи бяха прегледани и одобрени от Комитета по етика на опитите с животни, Висше училище по медицински науки, Университет Кюшу.

Измерване на кръвна глюкоза и интраперитонеално тестване на инсулинов толеранс.

Взети са кръвни проби от опашната вена на всяка мишка. Плазмените концентрации на глюкоза и инсулин се определят, като се използва съответно глюкозооксидазен метод и ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA; Morinaga Institute of Biological Science, Йокохама, Япония). Концентрациите на адипонектин в плазмата и лептин също се определят чрез ELISA (Wako, Осака, Япония). Степента на инсулинова резистентност се оценява с помощта на тест за инсулинова толерантност (ITT). Накратко, мишките бяха инжектирани с 2 U/kg човешки биосинтетичен инсулин (Novo Nordisk, NJ, САЩ), след това кръвни проби бяха събрани на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минути и техните концентрации на глюкоза бяха измервани, както описано по-горе. Оценката на хомеостазния модел на инсулинова резистентност (HOMA-IR) беше определена, както е описано по-рано [16, 17].

Хистологичен анализ на бяла мастна тъкан (WAT).

WAT се събира от интраабдоминалната перигонадна мастна подложка, за която преди това е доказано, че е метаболитно значима и място, на което се развива възпаление по време на затлъстяване, и се претегля [18]. Двустранните перигонадални мастни накладки бяха дисектирани и претеглени и масата на мастната подложка беше изчислена като процент от телесната маса. За да се изчисли размерът на адипоцитите [19], фиксирани с формалин, вградени в парафин WAT секции бяха оцветени с хематоксилин и еозин, а 100 адипоцита на мишка бяха количествено оценени чрез микроскопия.

Екстракция на РНК и количествена RT-PCR.

Обща РНК беше извлечена от замразени епидидимни мастни проби с помощта на RNeasy Adipose Tissue Mini Kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA), съгласно инструкциите на производителя. Екстрахираната РНК (1 μg) се транскрибира обратно в едноверижна cDNA, използвайки QuantiTect комплект за обратна транскрипция (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ). Специфични нива на експресия на иРНК са измерени чрез количествена RT-PCR, като се използва iTaq SYBR Green mix (Bio-Rad) и Bio-Rad Chromo 4/Opticon cycler. PCR реакциите за всяка прицелна кДНК бяха извършени, използвайки условията, показани в таблици S1 – S3. Линейността на усилванията като функция от броя на цикъла беше оценена в предварителни експерименти. Експресията на тРНК на всеки ген се нормализира до експресията на референтния ген β-актин.

Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на JMP статистически софтуер, версия 13 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). За клиничното проучване непрекъснатите променливи бяха анализирани с помощта на ранговата корелация на Spearman и категоричните променливи, използвайки U-теста на Mann-Whitney за едновариатен анализ на връзката между концентрацията на серумен билирубин, разпределението на телесните мазнини и всеки параметър. Бяха проведени многовариантни линейни регресионни анализи за контрол на потенциалните объркващи фактори. Полът беше кодиран като фиктивна променлива. Непрекъснатите данни са обобщени като медиани и интерквартилни диапазони (IQR), а категориалните променливи като абсолютни числа (%). За изследването върху животни всички данни са изразени като средни стойности ± SEM. Статистическият анализ беше извършен с помощта на t-критерия на Student или еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от защитения тест за най-малка значима разлика на Fisher. P Таблица 1. Демографски и клинични характеристики на кохортата на пациента (N = 176).

Връзката между концентрацията на серумен билирубин и други променливи е показана в Таблица 2. HDL-C е положително свързан със серумна концентрация на билирубин, докато ИТМ, WC, TG, UA, Cre и VFA са обратно свързани с концентрацията на серумен билирубин. Дори след корекция за потенциални смутители, серумната концентрация на билирубин е свързана обратно с VFA (Таблица 2). Връзките между разпределението на телесните мазнини и други променливи са показани в таблица S4. След корекция VFA корелира с възрастта, пола, WC, HbA1c, HDL-C, билирубина и Cre. Няма обаче връзка между серумната концентрация на билирубин и SFA (таблица 2 и таблица S4).

Изследване на животни

Телесна маса, концентрация на глюкоза на гладно и епидидимална мастна маса.

За да изследваме потенциалните механизми, подкрепящи асоциациите, идентифицирани в клиничното проучване, проведохме проучване върху животни, за да определим дали билирубинът намалява масата на мастната тъкан и подобрява индуцираната от затлъстяването инсулинова резистентност. Както е показано на фигура S1, има значителна разлика в телесната маса между мишки, хранени с CD и HFD, между 8 и 16 седмична възраст. На 16-седмична възраст кръвната глюкоза е била значително по-висока при HFD хранени, отколкото при CD мишки (Таблица 3). От този момент нататък биливердин (20 mg/kg дневно) се прилага перорално на половината от HFD-хранени мишки в продължение на 2 седмици. На 18 седмична възраст след хранене с контролна диета на прах, допълнена със или без биливердин в продължение на 2 седмици (S1 Фиг.), Няма разлика в гладуването и храненето на кръвна захар между мишки, хранени с CD, мишки, хранени с HFD, и третирани с биливердин HFD-хранени мишки (Таблица 3). Както е показано в Таблица 3, телесната маса на мишки, хранени с HFD, е значително по-висока от тази на мишки, хранени с CD, хранени на възраст от 18 седмици, но не се повлиява значително от лечението с биливердин. Масата на мастната подложка е по-висока при нетретирани мишки, хранени с HFD, отколкото при мишки, хранени с CD, хранени след възрастта след 2 седмици лечение (Таблица 3), но няма разлика в масата на мастна подложка между мишки, хранени с CD и HFD, третирани с биливердин -хранени мишки.

Ефект от лечението с биливердин върху инсулиновата резистентност.

След това определихме ефекта от лечението с биливердин върху инсулиновата резистентност. HOMA-IR беше значително увеличен при нелекувани мишки, хранени с HFD, в сравнение с мишки, хранени с CD, хранени след 2 седмици лечение (Таблица 3), но няма разлика в HOMA-IR между мишки, хранени с CD и HFD, третирани с биливердин -хранени мишки. По време на ITTs, въпреки че концентрацията на глюкоза в кръвта на нелекувани мишки, хранени с HFD, е била по-висока от тази на мишките, лекувани с HFD, третирани с биливердин, за 30 и 60-минутни моменти, няма значителни разлики между мишки, хранени с CD и биливердин HFD-хранени мишки (Фигура 1). Тези данни предполагат, че лечението с биливердин облекчава индуцирана от HFD инсулинова резистентност.

Изследването на инсулиновия толеранс се извършва при мишки след 2 седмици лечение. Концентрациите на кръвната глюкоза се изразяват в проценти от базалната кръвна глюкоза. Контролни мишки (○), HFD мишки (●) и HFD мишки, лекувани с биливердин (BVD) (▲). Резултатите са изразени като средни стойности ± SEM (n = 8). * P Фиг. 2. Ефекти на биливердин (BVD) върху размера на адипоцитите.

Представителни фотомикрографии (A), средна площ на адипоцитите (B) и хистограма на площ на адипоцитите (C), получени от участъци на мастната тъкан, оцветени с хематоксилин и еозин. За количествена оценка бяха използвани сто адипоцита на мишка. Контролни мишки (○), HFD мишки (●) и HFD мишки, третирани с BVD (▲). Резултатите са изразени като средни стойности ± SEM (n = 3). Мащабна лента, 100 μm. Оригинално увеличение, × 200. * P Фигура 3. Ефект на биливердин (BVD) върху генната експресия.

Експресията на маркери на макрофаги (A), адипоцитокини (B), главни регулатори на адипогенезата (B) и NAD (P) H оксидазни компоненти (C) бяха измерени в бяла мастна тъкан. Общата РНК беше извлечена от белите мастни тъкани на контролни мишки (отворени решетки), хранени с високо съдържание на мазнини (HFD) (затворени решетки) и HFD мишки, третирани с биливердин (BVD) (излюпени решетки). експресията на иРНК се измерва с помощта на RT-PCR в реално време и се нормализира до експресията на β-актин. Резултатите са изразени като средни стойности ± SEM. (п = 8). * P Фиг. 4. Серумни концентрации на адипонектин и лептин.

Контролирайте мишки (отворени решетки), хранени с високо съдържание на мазнини (HFD) (затворени решетки) и HFD мишки, лекувани с биливердин (BVD) (излюпени решетки). Резултатите са изразени като средни стойности ± SEM (n = 8). * P 2 (IQR, 22,1–28,9 kg/m 2) при включените пациенти със захарен диабет тип 2, въпреки че използвахме модел на HFD-индуцирани затлъстели мишки в проучване върху животни. Следователно, ние също трябва да изследваме група пациенти със затлъстяване (ИТМ> 30 kg/m 2) в бъдещо клинично проучване.

В заключение, това проучване показа, че концентрацията на серумен билирубин е обратно свързана с VFA при пациенти със захарен диабет и че приложението на биливердин облекчава инсулиновата резистентност, потенциално чрез подобряване на възпалението на мастната тъкан, разширяването на адипоцитите и нарушаването на регулацията на адипоцитокините при HFD-хранени мишки . По този начин, нашите открития показват, че билирубинът може да подобри висцералното затлъстяване и инсулиновата резистентност, което го идентифицира като потенциална цел за нови терапии за защита срещу инсулинова резистентност при пациенти с висцерално затлъстяване и диабет.

Подкрепяща информация

S1 Таблица. Условия и специфични праймери за PCR методи в реално време.

Таблица S2. Условия и специфични праймери за PCR методи в реално време.

S3 Таблица. Условия и специфични праймери за PCR методи в реално време.

Таблица S4. Корелации между разпределението на телесните мазнини и други променливи.

S1 Фиг. Експериментален протокол и телесно тегло.

Тематични области

За повече информация относно предметните области на PLOS кликнете тук.

Искаме вашите отзиви. Имат ли смисъл тези предметни области за тази статия? Щракнете върху целта до неправилната тема и ни уведомете. Благодаря за вашата помощ!

Е тематичната област "Мастна тъкан" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Билирубин" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Инсулинова резистентност" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Адипоцити" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Захарен диабет" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Възпаление" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Затлъстяване" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Макрофаги" приложим за тази статия? да не