РЕЗЮМЕ

Helicobacter pylori заразява човешкия стомах и причинява гастрит, като подгрупа пациенти развиват язвена болест, стомашен карцином и лимфоидна тъканна лимфома, свързана със стомашната лигавица (20, 32). Инфекцията на мишки C57BL/6 с H. pylori или Helicobacter felis води до хроничен активен гастрит (26, 27) и е използвана за изследване на имунната основа на гастрит, индуциран от H. pylori. Хеликобактерните инфекции при хора и мишки индуцират Th1-преобладаващ имунен отговор с активиране на CD4 + Т лимфоцити и експресия на провъзпалителни цитокини като гама интерферон (IFN-γ) (24, 30). Този клетъчно-медииран имунитет води до гастрит, характеризиращ се с мононуклеарни клетъчни инфилтрати, лигавична хиперплазия и чревна метаплазия. За разлика от тях, имунодефицитни B6.129S7-Rag1 tm1Mom мишки, които нямат зрели В и Т клетки, колонизирани при висока плътност с H. felis, но развили само минимален гастрит (37), което показва важността на адаптивния имунен отговор към свързано с хеликобактер стомашно заболяване.

регулаторни

Последните данни показват, че различните субпопулации на CD4 + Т лимфоцитите играят различни роли в медиирането и регулирането на гастрит, индуциран от H. pylori. При мишките B6.CB17-Prkdc с киселина приемният трансфер на див тип (wt) CD4 + CD45RB hi-ефекторни T (TE) клетки от наивни донори причинява тежък гастрит при инфектирани с H. pylori реципиенти, докато cotransfer на wt CD4 + CD45RB lo регулаторни Т (TR) клетки, защитени срещу развитие на гастрит (11). TR клетките също са дефинирани чрез експресия на α-веригата на интерлевкин-2 (IL-2) рецептор и Foxp3 (4), транскрипционният фактор на вилицата, критичен за тимусната селекция на CD4 + CD25 + TR клетки (21). Изчерпването на CD25 + Foxp3 + TR клетки в заразени с H. pylori мишки C57BL/6 доведе до загуба на имунна регулация и по-тежък гастрит (34), както и при осиновяването на лимфоцити, изчерпани от CD4 + CD25 + клетки в H. pylori- заразени B6.Cg-Foxn1 получатели nu (nu/nu) (35). От многото Т-клетъчни подмножества с приписана регулаторна функция (22), експериментите за сортиране на клетки обикновено използват CD4 + CD25 + CD45RB lo като естествени TR клетки. Въпреки това, механизмът (механизмите) за регулиране от този тип TR клетки не са напълно изяснени.

В моделите на приемни трансфери, използващи съвместно администриране на wt TE клетки и wt или IL-10-дефицитни (IL-10 -/-) TR клетки, се оказа, че IL-10 е от съществено значение за функцията на TR клетките за потискане на възпалително заболяване на червата, дисплазия и рак на дебелото черво (3, 13). Въз основа на тези доказателства, ние оценихме H. pylori гастрит при мишки B6.129S6-Rag2 tm1Fwa (Rag2 -/-), които са получили wt CD4 + CD25 - CD45RB hi TE клетки и CD4 + CD25 + CD45RB lo TR клетки от която и да е w57 C57BL/6 или вродени мишки IL-10 -/-. Резултатите показват, че ТЕ клетки медиират гастродуоденит при Rag2 -/- мишки независимо от инфекцията с H. pylori и че wt TR клетки потискат тази лезия в по-голяма степен, отколкото IL-10 -/- TR клетките. Само wt TR клетки потискат адитивен корпус гастрит, който се дължи на инфекция с H. pylori. Данните подкрепят разделните разлики в TE и H. pylori-медиираното възпаление на стомаха и разликите в регулаторните ефекти между wt и IL-10 -/- TR клетки, което предполага, че експресията на IL-10 от wt TR клетки е важна за регулаторното потискане на стомашно възпаление.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Инфекция с H. pylori. H. pylori Sydney щам 1 се използва за орално инокулиране, както е описано по-горе (16, 19). H. pylori се отглежда в продължение на 24 часа при 37 ° С при микроаеробни условия в бруцела бульон с 10% фетален говежди серум. Инокулумът се суспендира във фосфатно буфериран физиологичен разтвор до оптична плътност при 600 nm от 1 000 и след това се оценява чрез Gram оцветяване и фазова микроскопия за чистота, морфология и подвижност, както и за уреазна, каталазна и оксидазна активност. Мишките се дават с 0,2 ml през ден за три дози. На контролните групи се дават 0,2 ml буфериран с фосфат физиологичен разтвор.

Сортиране на клетки и приемане на трансфер. Едноклетъчни суспензии от далаци и мезентериални лимфни възли на wt или IL-10 -/- мишки се приготвят, както е описано по-горе (12). Накратко, CD4 + клетки бяха изолирани с помощта на CD4 Dynabeads и CD4 DETACHaBEAD (Dynal, Осло, Норвегия). След това клетките бяха маркирани с анти-CD4-Cy, анти-CD45RB-флуоресцеин изотиоцианат и анти-CD25-фикоеритринови антитела (Pharmingen, La Jolla, CA) и след това сортирани по поточна цитометрия (модел Mo-flo; Cytomation Inc., Fort Collins, CO) до чистота> 95% за wt TE клетки (CD4 + CD25 - CD45RB hi) и wt или IL-10 -/- TR клетки (CD4 + CD25 + CD45RB lo). Анестезирани Rag2 -/- мишки се инжектират в ретро-орбиталния синус с 3 × 10 5 TE клетки самостоятелно или в комбинация с 3 × 10 5 тегловни или IL-10 -/- TR клетки, суспендирани в 200 μl разтвор на балансирана сол на Hanks.

Хистологична оценка. При аутопсия стомахът и проксималният дванадесетопръстник бяха отстранени и разрязани по протежение на по-голямата кривина. Линейни стомашни ленти от по-малката кривина бяха фиксирани за една нощ в 10% неутрално буфериран формалин, вградени, нарязани на 4 μm и оцветени с хематоксилин и еозин (H-E). Лезиите се оценяват от ветеринарен патолог, заслепен за идентичност на пробата, както е описано по-рано (36). Индексите на общите лезии са изчислени чрез добавяне на индивидуални резултати за всяка оценка, описана в таблица 1, с изключение на лигавичната метаплазия и хиалиноза, които са наблюдавани да се развиват спонтанно при мишки (23), както и от инфекция с H. felis (15, 43).

Стомашни лезии при 16 и 20 WPI с H. pylori

Специални петна и имунохистохимия. Селективните тъкани се характеризират с помощта на специални петна и имунохистохимия. Киселинни (чревен тип) муцини бяха демонстрирани, използвайки рН 2,5 Alcian blue, последвано от периодична киселина-Schiff, за да оцветят оставащите неутрални (стомашен тип) муцини (36). Макрофагите се оцветяват с моноклонално антитяло F4/80 (1: 150; Caltag Laboratories, Burlingame, CA) и с комплекс от авидин-биотин-пероксидаза (Vector Laboratories, Burlingame, CA) в съответствие с инструкциите на производителя.

Количествена култура на H. pylori. Колонизацията на H. pylori в стомаха се оценява чрез количествена култура, както е описано по-горе (16). Накратко, тъканите от корпуса и антрала се претеглят и хомогенизират в 250 μl бульон от бруцела с помощта на стерилна мелничка за стъклена тъкан. Хомогенатът се разрежда последователно 10- и 100-кратно в бульон от бруцела и се посява върху селекционни плаки, съдържащи 5% конска кръв, 250 μg/ml амфотерицин В, 7 μg/ml бацитрацин, 10,7 μg/ml налидиксинова киселина, 3,3 μg/ml полимиксин и 100 μg/ml ванкомицин. Плаките се инкубират микроаеробно при 37 ° С в продължение на 7 дни. Брояха се бактериални колонии и се изчислява броят на CFU на грам тъкан.

Статистически анализ. Заболеваемостта между групите е сравнена чрез логаритмичния тест. Резултатите от Lesion са сравнени чрез U-тест на Mann-Whitney или чрез еднопосочен дисперсионен анализ на Kruskal-Wallis с теста на Dunnett. Нивата на експресия на цитокини и Foxp3 и данните за колонизация на H. pylori (след лог трансформация) бяха сравнени с помощта на теста на Newman-Keuls. Статистическият анализ беше извършен с използване на търговски софтуер (Graphpad Prism 4.0; Сан Диего, Калифорния) със значимост при P стойност на Rag2 -/- мишки, получаващи TE-клетки, развиха заболеваемост и гастродуоденит, независимо от инфекция с H. pylori. Контролирани с H. pylori и без хеликобактер Rag2 -/- мишки, които не са получили клетъчни трансфери, са били клинично нормални през целия 20-седмичен период на изследване. За разлика от тях, 7 от 10 неинфектирани реципиенти на TE-клетки и 3 от 12 заразени с H. pylori TE-клетки-реципиент Rag2 -/- мишки умират остро или развиват диария и влошено телесно състояние, което налага ранна евтаназия между 4 и 12 седмици след трансфера на Т клетки (Таблица 1). Всички останали неинфектирани и заразени с H. pylori Rag2 -/- мишки, които са получили ТЕ клетки, са били подложени на некропсия на 12 седмици след трансфера на Т клетки, което също е било 16 седмици след инфекция (wpi) с H. pylori.

Прехвърлянето на wt TE клетки в Rag2 -/- мишки води до имуно-медииран пангастрит и гастродуоденит. (а) Нормално сквамозно стомашно отделение на Rag2 -/- мишка, което не е получило ТЕ клетки. (b) ТЕ-клетъчният трансфер води до възпаление на сквамозния стомах с реактивна хипертрофия на епителните клетки и пликация на повърхностната лигавица. (в) Трансферът на ТЕ-клетки също причинява възпаление в кардията и корпуса. (г) Гастрит, медииран от ТЕ клетки, на жлезистата и оксинтичната лигавица води до оксинтична атрофия, характеризираща се със загуба на париетални и главни клетки. (д) Нормални жлези на Brunner (стрелка) в проксималния дванадесетопръстник. (е) ТЕ-клетъчният трансфер води до дуоденит с почти пълна загуба на жлезите на Brunner поради атрофия и тубулодуктуларна метаплазия (стрелка). За тези проби е използвано H-E оцветяване. Лента, 200 μm.

За развитие на гастрит, свързан с H. pylori, е необходим адаптивен имунитет. Когато се оценяват при 20 wpi, стомаха и чревния тракт на заразени с H. pylori Rag2 -/- мишки изглеждат напълно нормални и са подобни на тези от незаразените Rag2 -/- мишки. Хистологично заразените с H. pylori Rag2 -/- мишки развиват само минимален корпус гастрит с разпръснати неутрофили (Таблица 1 и Фиг. 2) и F4/80 + макрофаги в субмукозата (не е показано). Инфектираните с H. pylori wt мишки бяха оценени, за да потвърдят силен гастрит от инфекция с H. pylori Sydney щам 1. Тези мишки са имали умерено грубо удебеляване на стомаха, придружено от хистологични лезии, състоящи се от значителна инфилтрация с мононуклеарни клетки и неутрофили, епителни дефекти оксинтична атрофия, чревна метаплазия и хиперплазия (Таблица 1) (P -/- мишки се дължи на възпалителната активност на донорски TE клетки.

Инфекция с H. pylori при Rag2 -/- мишки със или без последващ трансфер на wt TE клетки самостоятелно или в комбинация с wt или IL-10 -/- TR клетки. (а) При липса на Т клетки, инфекцията с H. pylori произвежда минимален до никакъв гастрит. (b) инфекция с H. pylori, последвана от трансфер на ТЕ клетки, произвеждащ умерен до тежък гастрит. (c) Котрансферът на wt TR клетки подобрява тежестта на стомашно възпаление при мишки, инфектирани с H. pylori, реципиенти на TE-клетки, но по неизвестни причини се развива изразена лигавична метаплазия на париеталните клетки (стрелка). (г) Котрансферът на IL-10 -/- TR клетки в заразени с H. pylori мишки, получаващи TE-клетки, намалява антралния гастрит, медииран от TE-клетки, загубата на клетки на Brunner и епителната дисплазия, но не намалява индуцираната от H. pylori индукция гастрит на корпуса. За тези проби е използвано H-E оцветяване. Лента, 200 μm.

Инфекцията с H. pylori обостри гастрит на корпуса при Rag2 -/- мишки с реципиент на ТЕ-клетки. Заразени с H. pylori Rag2 -/- мишки, които са получили ТЕ клетки при 4 wpi и са били некропсирани при 16 wpi, са били клинично засегнати в подобна степен като незаразените Rag2 -/- мишки, които са получавали ТЕ клетки сами. Неочаквано заразените с H. pylori мишки, получаващи TE-клетки Rag2 -/-, имат по-малка смъртност от неинфектираните реципиенти на TE-клетки, като 9 от 12 мишки оцеляват до времевата точка от 16 wpi (P -/- мишки, което предполага, че TE клетки медиираха антралния гастрит, дуоденит и разрушаването на жлезите на Brunner.Тези резултати също показват, че инфекцията с H. pylori допълнително насърчава гастрита на корпуса, който е наложен върху независим от H. pylori гастродуоденит.

Нивата на колонизация на H. pylori се намаляват от ТЕ клетки и се поддържат, когато wt TR клетки се прехвърлят. Съобщава се, че нивата на колонизация на H. pylori са в обратна зависимост от тежестта на свързания хроничен гастрит при мишки (38). В съответствие с липсата на възпалителен отговор, заразените с H. pylori Rag2 -/- мишки, които не са получили Т клетки, са били колонизирани на нива 3 до 5 дневника, по-високи в корпуса и антрума, съответно, отколкото в заразените, TE-клетъчни- реципиентни Rag2 -/- мишки (Фиг. 4) (P -/- TR клетки са намалили колонизацията на корпуса, подобно на заразените мишки, които са получили ТЕ клетки само (P = 0,43), което предполага, че IL-10 -/- TR клетките не са успели да повлияят ТЕ-клетъчно медиирано инхибиране на H. pylori. В antrum, wt TR клетки поддържат по-високи нива на колонизация, отколкото при заразени мишки, които са получили ТЕ клетки самостоятелно (P -/- TR клетки е подобно на заразените мишки, получаващи ТЕ клетки само (P = 0,19) (Фиг. 4б).

В обобщение, нашите данни демонстрират ролята на ТЕ клетките като един от компонентите на адаптивния имунитет, който може да отключи и поддържа гастродуоденално възпаление при липса на TR клетки. Инфекцията с H. pylori, съчетана с ТЕ-клетъчен трансфер, води до по-тежък гастрит на корпуса, който се отличава в отделни части от гастродуоденит, медииран от ТЕ-клетки. Освен това, нашите резултати показват, че IL-10 компетентността на TR клетките изглежда е изискване за потискане на индуцирания от H. pylori гастрит, но не е толкова критична за подобряване на ТЕ-клетъчно-медиирания гастродуоденит или защита срещу свързаната заболеваемост. Тези резултати са съвместими с предишни доклади, че индуцираният от H. pylori гастрит при мишки се регулира от IL-10-зависим, Th1-тип имунен отговор (5, 44), вероятно чрез функцията на CD25 + Foxp3 + TR клетки (34 ) и е в съответствие с увеличената експресия на Foxp3 при wt получатели на TR-клетки. Разликите в отделните части на TE-клетъчно и H. pylori-медиирано възпаление и диференциална регулация от wt или IL-10 -/- TR клетки трябва да се окажат ценни за изследване на бактериален и имуно-медииран гастрит.

ПРИЗНАВАНИЯ

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства R01AI37750, R01AI50952, P01CA26T31 и P30ES02109 (J.G.F.).

Благодарим на Вивиан Нг и Филип Лий за грижи и изваждане на животни, Кати Кормие за хистология и имунохистохимия, Санди Ксу и Нанси Тейлър за количествена култура, Куо-Лионг Чиен за съдействието при статистически анализ и Глен А. Паради и Микеле Пери за техния експерт помощ при сортиране на клетки.