Принос от Луис Т. Уилямс

диабета

Резюме

Затлъстяването е сложно разстройство и често води до периферна хиперинсулинемия, хипергликемия и инсулинова резистентност (1–3). Затлъстяването също е основен рисков фактор за хипертония и сърдечно-съдови заболявания (3). Ясно е, че има множество пътища, които контролират сложния баланс на калориен прием и разход. Приемът на калории се контролира от молекули, които включват лептин, лептинов рецептор, меланин концентриращ хормон, меланокортин 4 рецептор, урокортин и невропептид Y и неговия тип 5 рецептор (4). При гризачи в генетично затлъстелите модели са идентифицирани няколко гена, отговорни за затлъстяването, включително затлъстяване (ob), мазнини (fa), аготи (ay) и диабет (db) (3, 5–7). Наскоро човешките и мишите ob гени бяха клонирани и секретираният генен продукт, наречен лептин, беше характеризиран (3, 8-11).

При ob/ob мишките мутацията в ob гена води до значително увеличаване на консумацията на храна, което води до увеличаване на масата на мастната тъкан и синдром, който прилича на болестно затлъстяване при хората (9). Аномалиите включват хипотермия, летаргия, хипергликемия, непоносимост към глюкоза и хиперинсулинемия, наподобяваща неинсулинозависим диабет мелитус при хората. Лептинът, секретиран от 16 kDa протеин, се произвежда изключително в мастната тъкан и се смята, че действа главно върху хипоталамуса, въпреки че рецепторите за лептин присъстват и в периферните тъкани (3, 12–14). Доказано е, че лептинът медиира неговия ефект чрез стимулиращия апетита пептид, невропептид Y (15). При ob/ob мишки многократното прилагане на рекомбинантен лептин намалява приема на храна, увеличава разхода на енергия и води до загуба на телесно тегло и мастна маса (8-11). Тези ефекти изискват непрекъснато приложение на рекомбинантния лептинов протеин; оттеглянето води до обръщане към фенотипа със затлъстяване (11). За разлика от рекомбинантната протеинова терапия, соматичната генна терапия предлага потенциал за продължително доставяне на липсващи протеини при метаболитни заболявания.

Адено-асоциираните вируси (AAV) представляват обещаваща система за доставка. Тези вектори са непатогенни и могат да инфектират както делящи се, така и неделящи се клетки. Векторната система се състои от AAV терминални повторения, които са необходими и достатъчни за репликация, опаковане и евентуално интегриране. Векторът AAV няма вирусно кодирани гени, като по този начин се избягват потенциални нежелани имунни отговори. Също така, AAV препаратите са стабилни и могат да се получат при високи титри (> 10 12 частици/ml) (16, 17). Има скорошни доклади, демонстриращи дългосрочна експресия на трансгени след доставяне на AAV вектори в белия дроб, черния дроб, мускулите, сърцето и мозъка (18–23).

В този доклад генерирахме рекомбинантен AAV (rAAV) вектор, носещ кДНК на миши лептин и демонстрирахме способността на този вектор да експресира лептин in vitro и in vivo. In vivo демонстрирахме, че един i.m. инжектирането на rAAV вектор, носещ лептин в ob/ob мишки, води до дългосрочна корекция (6 месеца) на всички тествани метаболитни аномалии, включително затлъстяване и диабет.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Vector Construction.

Подготовка и титриране на rAAV частици.

rAAV векторите са получени чрез модифициран преходен протокол за трансфекция на плазмиди (27). Накратко, 293 клетки на човешки ембрионален бъбрек, отгледани до 60% сливане в 15-сантиметрова чиния, бяха котрансфектирани с 12,5 μg помощен плазмид pKS rep/cap и 12,5 μg вектор плазмид pCMVAAV-m-лептин или pCMVAAV-lacZ с помощта на калций метод на съвместно утаяване с фосфати. След 8 часа трансфекционната среда беше заменена с модифицираната от Iscove среда на Dulbecco + 10% фетален говежди серум, съдържащ аденовирус тип 5 dl312 при множественост на инфекцията от 2. Седемдесет и два часа след инфекцията, клетките бяха събрани в буфер на Hepes (2,5 ml на съд ) и се лизира от три цикъла на замразяване и размразяване. Клетъчният лизат се центрофугира при 2000 х g в продължение на 20 минути, за да се отстранят клетъчните остатъци. Пакетираният rAAV вирус се пречиства чрез два кръга градиенти на равновесна плътност на цезиев хлорид за отстраняване на замърсяващи протеини и се нагрява при 56 ° С в продължение на 45 минути, за да инактивира остатъчните аденовирусни частици. За оценка на общия брой векторни частици, векторът се третира с DNase 1 и капсулираната ДНК се екстрахира с фенол-хлороформ, утаен с етанол. Освободената ДНК се сравнява с известен стандарт чрез точков петен анализ.

In vitro анализ на rAAV-лептин.

rAAV-лептиновите частици се разреждат в 2 ml IMDM + 10% фетален говежди серум и се добавят към човешки ембрионален бъбрек 293 клетки, поставени при 50% сливане върху 6-ямково блюдо. Вирусът се оставя върху клетките за 24 часа, клетките се измиват и се добавят 2 ml пресен IMDM + 10% фетален говежди серум. Събира се супернатант за анализ на Western blot или RIA (24-48 часа постинфекция). За трансфекции, 2 μg pCMV-AAV-m-лептинов плазмид се инкубира с 10 μl трансфекционен реагент LT1 (Panvera, Madison, WI) и се добавя към 5 × 10 5 човешки ембрионални бъбречни 293 клетки, засяти върху 6-ямкови съдове. Комплексите се инкубират с клетки в продължение на 4 часа и се захранват отново с 2 ml среда. Клетъчната супернатанта се събира 48 часа след трансфекцията и се анализира чрез Western blot или RIA.

Анализ на Western Blot.

Супернатантът (10 μl) от заразени или трансфектирани клетки се смесва с 5 μl 3 × буфер Laemmli и се вари до денатуриране на протеини. Денатурираните супернатанти бяха електрофоретично разделени на 14% SDS/PAGE (NOVEX, Сан Диего) и прехвърлени върху нитроцелулоза. Петната се изследват през нощта при 4 ° С с разреждане на заешко антилептиново антитяло (11) в PBS + 0,1% Tween + 0,2% обезмаслено сухо мляко. След продължително измиване се добавя конюгат от хрян пероксидаза от кози анти-заешки IgG (Boehringer Mannheim). След 1 час инкубация и допълнително измиване, имунореактивните ленти се визуализират чрез хемилуминесценция (ECL комплект, Amersham).

In Vivo администриране на rAAV-лептин.

Женски мишки C57BL/6J-ob/ob (на възраст 4-6 седмици) са получени от лабораторията Джаксън. След анестезия със смес от кетамин и ксилазин, 50 μl нормален физиологичен разтвор или нормален физиологичен разтвор, съдържащ 5 × 10 10 или 1 × 10 11 rAAV частици, се инжектира в предния тибиален мускул. При някои експерименти двата крака са инжектирани в два последователни дни, докато при други експерименти са инжектирани два пъти повече частици за един ден.

Тест за толерантност към глюкоза.

Животните бяха на гладно в продължение на 18 часа и от опашната вена се събира кръв, за да се определят нивата на глюкозата на гладно. След това мишките получават 1 mg/g телесно тегло стерилен глюкозен разтвор чрез i.p. инжекция. Кръвни проби се събират на 15, 30, 60, 120 и 180 минути след инжектирането и циркулиращата глюкоза се измерва с помощта на монитора Lifescan (Mountain View, CA).

Серумни нива на инсулин, глюкоза и лептин.

Кръв се взима от мишки в определени часове чрез ретроорбитални кръвоизливи на анестезирани от изофлуран мишки. Нивата на кръвната глюкоза се определят с помощта на монитор за глюкоза Lifescan One Touch Basic. Нивата на инсулин са измерени с комплекта Linco Rat Insulin RIA (Linco Research Immunoassay, St. Charles MO). Нивата на лептин са измерени с комплекта за мишка Linco Leptin RIA.

Статистика.

Статистическите данни са изчислени с помощта на проба Т на Mann-Whitney с две проби. Изчисленията бяха извършени на софтуерната програма instat.

РЕЗУЛТАТИ

Векторна конструкция и in vitro анализ.

Анализ на експресията на лептин in vitro. Супернатантът се събира от човешки 293 клетки и се анализира чрез Western blot (A) или RIA (B). (A) Western blot анализ на супернатант от клетки, заразени с 1 × 10 9 (път 1), 1 × 10 10 (път 2) AAV-лептинови частици, подигравани заразени клетки (път 3) или клетки, трансфектирани с 2 μg pCMVKm201- лептин (път 4). (Б) Количествено изразяване от АПИ.

Ефект от интрамускулното инжектиране на AAV лептин върху наддаването на тегло и приема на храна.

Ефект от лечението с rAAV-лептин върху телесното тегло и приема на храна. Мишки получиха i.m. инжекции на 10 11 частици rAAV-лептин (○), β-галактозидаза (□) или физиологичен разтвор (▵), а теглото се наблюдава три пъти седмично. (А) Средно ± SEM на 10 мишки от всяка група. За улеснение се показва само една точка от време за всяка седмица. (Б) Мишките бяха затворени в клетки от по пет души и беше измерен приемът на храна за период от 24 часа. Показана е средната консумация на храна на мишка на ден. Разликата между двете клетки във всяка група е незначителна.

Външен вид на мишки след лечение с rAAV-лептин. Мишките са снимани 6 седмици след лечение с rAAV-лептин (вляво) или физиологичен разтвор (вдясно).

Мониторингът на приема на храна е започнал през третата седмица след инжектирането. Претеглената стандартна храна за мишки се добавя към клетките (съдържащи пет мишки) всяка вечер и количеството консумирана храна се измерва на следващия ден. Намаляването на приема на храна на лекувани мишки съответства на степента на загуба на тегло. В най-ранните наблюдавани моменти от времето (ден 18-23) мишките, лекувани с rAAV лептин, ядоха средно по 3,4 g храна на мишка в сравнение със средно 5,1 g за контролирани с физиологичен разтвор (фиг. 2В). На следващата седмица (ден 24-29) мишките ядат средно 2,9 g храна на ден, а нетретираните мишки ядат 4,6 g на ден. От седмици 4–7 (ден 33–47), лекуваните с лептин мишки постоянно консумират средно 1,9 g храна на ден и до 9 седмица консумацията е ≈2,3 g на ден. През седмици 10 и 11, консумацията на лекувани с лептин мишки се изравнява с 2,75 g на мишка на ден и остава на това ниво до 15-та седмица. Въпреки че приемът на храна леко нараства след 15-та седмица, лекуваните мишки никога не ядат> 3,5 g храна на ден . По време на проучването, контролите на физиологичния разтвор са яли средно 4,6 g на мишка на ден.

В проучване, за да се гарантира, че наблюдаваната загуба на тегло не се дължи на страничен ефект от инжектирането на rAAV, ob/ob мишките се инжектират с 1 × 10 11 rAAV-β-галактозидазни частици като отрицателна контрола. Кинетиката на наддаване на тегло за третираните с β-галактозидаза мишки е идентична с мишките, третирани с физиологичен разтвор в първоначалния експеримент (фиг. 2А).

Нива на серумен лептин.

Циркулиращи нива на лептин. Серумът се събира от мишки в посочените часове и нивата на лептин се измерват с помощта на комплекта Linco RIA. Стойностите са средно за пет мишки ± SEM. Мишки от седмица 7 бяха на гладно в продължение на 18 часа преди събирането на серума. Мишките, тествани на седмици 5, 9, 11 и 14, се хранят ad libitum преди събиране на серум. Серум не е бил събран от мишки C57 на седмици 5 и 14. (Р стойности за третирани спрямо нелекувани са съответно 0,09, 0,0005, 0,007, 0,0079 и 0,0079 за седмици 5, 7, 9, 11 и 15).

Измервания на серумен инсулин и глюкоза.

Фенотипът ob/ob се характеризира с инсулиноустойчив диабет; ob/ob мишките са хипергликемични, въпреки повишените нива на циркулиращ инсулин. За да се определят ефектите от лептиновата генна терапия върху диабета, се измерват кръвната захар и инсулин на гладно. На 6-та седмица всичките пет тествани с физиологичен разтвор мишки са били хипергликемични (фиг. 5А). Нивата на глюкозата на гладно варират от 168–355 mg/dl (норма = 91–129 mg/dl) със средно 259,2. За разлика от това, всички мишки, лекувани с rAAV-лептин, са били в рамките на или малко под нормалния диапазон със средно за групата 91,2 mg/dl и диапазон от 74–125 mg/dl. Измерват се и нивата на инсулин в серума от тези гладни мишки (Фиг. 5b). Всички подигравани животни показват изразена хиперинсулинемия със серумни нива на инсулин между 8 и 20 ng/ml. Средната серумна концентрация на инсулин за животни, лекувани с rAAV-лептин, е 0,54 ± 0,2 ng/ml. Това е в нормалните граници от 0,4 ± 0,1 ng/ml.

Ефекти на rAAV-лептин върху метаболизма на глюкозата и секрецията на инсулин. Нелекувани мишки C57 или ob/ob мишки, лекувани с rAAV-лептин или физиологичен разтвор, бяха на гладно в продължение на 18 часа и обезкървени за определяне на глюкоза на гладно (A) и инсулин (B), 6 седмици след инжектирането. Стойностите, представени тук, са средната стойност ± SEM на пет мишки. (C) Глюкозният толеранс се определя при мишки с физиологичен разтвор (▵), лекувани с rAAV-лептин (○) или C57 (∗) чрез измерване на нивата на кръвната глюкоза в указани моменти след i.p. инжектиране на глюкоза. Стойностите са средните стойности ± SEM на три мишки от всяка група. Тестовете бяха проведени на гладни мишки, 8 седмици след инжектиране.

Тест за толерантност към глюкоза.

Бяха проведени тестове за толерантност към глюкоза, за да се измери способността на мишките, третирани с rAAV-лептин, да изчистват глюкозата от циркулацията. На 8 седмици след векторното приложение се инжектира болус от 1 mg/g глюкоза i.p. в гладни мишки и глюкозата в кръвта се следи с течение на времето. При контролните мишки C57 и лекуваните с лептин ob мишки нивото на циркулиращата глюкоза достига пик на 30 минути и се връща към нормалното в рамките на 120 минути (фиг. 5в). При подправени мишки ob/ob, нивото на глюкоза е било поне 2 пъти по-високо от лекуваните с лептин мишки през всички времеви моменти. Нивата на глюкозата при тези мишки не се нормализират в рамките на 3-часовия ход на проучването.

ДИСКУСИЯ

Ние генерирахме rAAV вектор, кодиращ миши лептин и характеризирахме експресията на лептин както in vitro, така и in vivo. Както е показано на Фиг. 1, rAAV вектор, кодиращ миши лептин, може да зарази 293 клетки и секретираният лептин мигрира при очаквания размер от 16 kDa. Ние също така определихме количествено количеството лептин, секретирано от тези клетки чрез RIA и нивата варират от 50-300 ng/106 клетки на 24 часа в зависимост от множеството инфекция. Интересното е, че забелязахме, че възможността за опаковане на вектора rAAV е чувствителна към размера на опакования векторен геном. Включването на PRE последователност за увеличаване на размера на вектора от 2,840–3,430 bp помогна за подобряване на функционалния титър (данните не са показани). Този резултат е в съответствие с констатациите на Dong et al. (29), които са демонстрирали пряка корелация между размера на генома и титъра на рекомбинантните AAV вектори.

За да демонстрираме ефективността на rAAV медиирана доставка на лептин за мишки, ние избрахме млади (на възраст 4–6 седмици) ob/ob мишки, които бързо наддават на тегло. Нашата цел беше да оценим ефикасността на соматичната генна терапия за предотвратяване на появата на затлъстяване и диабет при тези мишки. По-ранни доклади, използващи рекомбинантен лептинов протеин, демонстрират, че протеинът може да бъде доставен или от i.p. или i.v пътища на администриране. Докладите, които демонстрират доставянето на лептин от гризачи чрез генна терапия, използват аденовирусна доставка (i.v) и експресията на трансгена вероятно се появява в черния дроб (30, 31). Администрирахме rAAV вектора от i.m. маршрут и контролиран прием на храна и наддаване на тегло за период от 6 месеца. В сравнение с мишки, третирани с физиологичен разтвор, мишките, лекувани с rAAV-лептин, са натрупали значително по-малко тегло, започвайки от седмица 1 до края на периода на наблюдение. Лекуваните животни започват да отслабват до седмица 4 и продължават да губят тегло до седмица 8, по това време теглото започва да се стабилизира. Към 8 седмица средното тегло на тези животни е много по-близо до съответстващите на възрастта контролни мишки C57, отколкото до нелекувани мишки ob/ob. Забележително е, че този ефект върху теглото продължава най-малко шест месеца.

Нивата на серумен лептин се наблюдават от RIA в пет времеви точки по време на експеримента (5, 7, 9, 11 и 14 седмици). Нивото на серумен лептин при мишки, лекувани с AAV-лептин, достига максимум между 5 и 7 седмица, период от време, през който загубата на тегло също е максимална. Изразът се запазва най-малко 14 седмици, като през това време мишките продължават да ядат по-малко храна от нелекуваните си връстници и поддържат ниско телесно тегло. Нивата на лептин в лекувани с rAAV лептин ob мишки са сравними с нивата на мишки C57BL (1,7-3,3 ng/ml срещу 2,3-4,19 ng/ml). По този начин, извънматочната експресия на физиологични нива на лептин може да предотврати появата на затлъстяване. Интересното е, че RIA, използвана в това проучване, също открива известна активност в нетретиран ob/ob миши серум. Това може да се дължи на наличието на ендогенен неактивен лептин, секретиран в този щам на мишките (ob дефектът се дължи на преждевременен терминиращ кодон в кодиращата последователност на лептин).

Нашите данни също показват корелация между загубата на тегло и количеството прием на храна при лекуваните мишки. В нашия експеримент приемът на храна при лекувани мишки постепенно намалява за период от 3–6 седмици и се стабилизира около седмица 8. Към 10 седмица средната консумация на храна при лекувани с лептин мишки е малко по-малка, отколкото при контролните мишки C57, съответстващи на възрастта (2,76 g/ден срещу 3,2 g/ден).

Хиперинсулинемията и инсулиновата резистентност могат да бъдат коригирани при лекувани с лептин мишки. Както е показано на фиг. 5, на седмица 6 е имало пълен обрат на хиперинсулинемия и хипергликемия при лекувани животни. Нивата на циркулиращия инсулин при лекуваните животни са подобни на нивата, съобщени за мишки C57 (.54 ng/ml срещу 0.40 ng/ml). Мишките, лекувани с rAAV-лептин, са имали нормален отговор на предизвикателство за глюкоза. На 8-та седмица контролните ob/ob мишки не успяха да коригират преувеличеното хипергликемично състояние след следбързо инжектиране на глюкоза. За разлика от това, лекуваните с лептин и съответстващи на възрастта мишки C57BL коригират своята хипергликемия. Това показва, че инсулиновата резистентност е коригирана и че тези мишки са в състояние да регулират правилно секрецията на инсулин в отговор на предизвикателство за глюкоза.

Нашият доклад показва, че доставката на лептин чрез i.m. маршрут може да доведе до коригиране на дефекта на ob. Също така е интересно да се отбележи, че загубата на тегло при лекуваните животни е много по-постепенна, отколкото се забелязва при експерименти, където се прилага болус от рекомбинантен протеин. Това отразява кинетиката на генната експресия от rAAV вектори. Експресията на маркерния ген от rAAV вектори, инжектирани в мускула на мишката, постепенно се увеличава за период от 4–6 седмици преди стабилизиране (непубликувани данни). За разлика от това, доставката на аденовирусен ген води до бързо начало на протеинова експресия, която се гаси в рамките на 2 седмици, вероятно чрез имунен отговор на аденовирусни протеини (30).

По този начин, соматичната генна терапия, използваща rAAV вектор, кодиращ миши лептин, може да доведе до пълна корекция на затлъстелия фенотип при ob/ob мишки. Предварителните експерименти показват, че i.m. Приложението на rAAV-m-лептин води до корекция на ob фенотипа при по-стари ob/ob мишки (12–13 седмици с тегло 53 g, данните не са показани). По-важното е, че нашите данни посочват, че дългосрочната корекция на генетичен дефект чрез соматична генна терапия е възможна от rAAV-базирани вектори.

В обобщение, демонстрирахме, че rAAV може да се използва като ефективен in vivo вектор за генна терапия. Директното инжектиране на rAAV вектори може да трансдуцира мускулите ефективно и да доведе до експресия, секреция и корекция на метаболитните нарушения. И накрая, стабилното персистиране на генната експресия чрез еднократна инжекция може да бъде полезно при лечението на множество метаболитни нарушения.

Благодарности

Признаваме Таня Йънг и Чарлз Вит за експертна помощ при всички процедури с животни. Също така благодарим на Джеймс Стефанс и Уенди Фантл за реагентите; Janice Hamer и Michelle Stampien за техническа помощ; и Джулия Кенеди за коментари по ръкописа.