Резюме

При космически полет намален тестостерон (Т) се наблюдава при мъжете астронавти (33), както и при мъжете плъхове (1). Предвид промените в половите хормони при мъжете след космически полет се предполага, че космическият полет ще повлияе по същия начин на женските полови хормони. Броят на жените астронавти се увеличава и много от тях може да не са създали или завършили семействата си по време на космически полет, но малко се знае за ефекта на космическия полет върху възпроизводството на жените. Серова и Денисова (32) съобщиха, че плъхове са се чифтосвали по време на космически полет, но не е имало раждания. Не съществуват данни за хора, защото жените астронавти потискат своите менструални цикли по време на космически полет (17). Ясно е, че са необходими повече проучвания, за да се отговори на основните въпроси относно женската репродуктивна функция в космоса.

В космическата среда хипогравитацията води до физиологични промени, като атрофия на мускулно-скелетната недостатъчност, изместване на течността в главата и стрес при адаптация, които могат да повлияят на репродукцията. Това има важни последици, тъй като времето, прекарано при условия на хипогравитация, се очаква да се увеличи, докато продължителността на космическите полетни мисии се удължава. Поради разходите и рядката възможност за провеждане на космически полети са разработени наземни симулационни модели на космически полет. За да се изучи ефектът от хипогравитацията, хората са подложени на 6 ° наклонена глава наклонена надолу. Жените, подложени на 17-дневна почивка на леглото с наклон на главата надолу, не показват промени в продължителността на менструалния цикъл (31). Въпреки това, 17-дневната продължителност на проучването беше твърде кратка, за да се направят окончателни заключения. В друго проучване, Рок и Фортни (29) съобщават, че жените, изложени на почивка в леглото, показват дефицит на лутеална фаза.

При проучвания върху животни моделът на суспензия на задните крайници на Морей-Холтън (HLS) се използва успешно за симулиране на основните физиологични ефекти, произведени от излагане на хипогравитация (21, 22). Моделът HLS включва окачване на плъхове за основата на опашката, за да се получи позиция 30 ° с главата надолу, която пречи на задния крайник да носи каквото и да е тегло, както и изместването на течността в посока нагоре в хипогравитационната среда на космоса. Съвпадащо с резултатите от космическия полет, HLS на мъжки плъхове води до намалена маса на тестисите и намалена плазмена Т (1). Доколкото ни е известно, нито едно проучване не е изследвало ефектите на HLS върху репродуктивната функция при небременни женски плъхове.

Също така изследвахме диетата, тъй като настоящата диета за космически полети се състои от полупречистена формулировка, докато наземните проучвания като HLS обикновено използват стандартна чау диета (37). Диетите на Американския институт по хранене (AIN) са диети с пречистени съставки, които са разработени, за да бъдат сравними със стандартните диети с чау. По този начин както пречистената диета, така и диетата с натурални съставки, често се използват в лабораторни експерименти. Въпреки това, тези диети не могат да се използват взаимозаменяемо, поради неотдавнашните предположения, че диетите с чау съдържат естествени ендокринни разрушители, известни като фитоестрогени (5). Диетичните фитоестрогени са съединения от растителен произход, които са структурно и/или функционално подобни на естрогените. Фитоестрогените действат двуфазно, индикирано от естрогенна активност в присъствието на нисък ендогенен естроген и антиестрогенна активност в присъствието на висок ендогенен естроген (5). Наскоро соята, една от многото храни, богати на фитоестрогени и често срещана съставка в лабораторните диети с животински чау, бе идентифицирана като объркващ елемент в репродуктивните и ендокринните изследвания (5, 19). Следователно диетата с чау може да е неподходяща за изследвания, изследващи репродуктивни крайни точки.

Това проучване сравнява употребата на пречистени срещу чау като стандартни диети поради опасения относно наличието на диетични фитоестрогени в диетата с натурална съставка чау, оказващи репродуктивни ефекти. Изключително важно е да се разбере ролята на диетата върху плодовитостта на жените. По подобен начин трябва да се обърне внимание на репродуктивните последици от излагането на жените на уникалната космическа среда, т.е. хипогравитацията. За да се изследва ефектът от диетата, HLS и комбинацията от диета и HLS, женските плъхове в репродуктивна възраст са хранени или с пречистен AIN-93G, или с чау-диета и подложени на HLS. Променените естроални цикли и нивата на хипофизната, репродуктивната и хормона на стреса бяха изследвани като показатели за нарушена репродукция.

Всички процедури, използвани в това проучване, съответстват на ръководството на Националния съвет за изследване за използването и грижите за лабораторни животни (24). Протоколът за животни за това проучване е одобрен от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните към Националния център за аеронавтика и космос (НАСА) Ames Research Center.

Животни и диети. Четиридесет и две 50-дневни девствени женски плъхове албиноси, получени от Sprague-Dawley, са получени от лаборатории Simonsen (Gilroy, CA). След получаване животните бяха настанени индивидуално в проектирани от НАСА HLS/метаболитни клетки (14) в стая, поддържана при 22 ± 2 ° C с 12: 12-часов цикъл светлина-тъмнина (6:00 AM светлини/6: 00 PM светва). При получаване на плъхове бяха разпределени на случаен принцип да бъдат хранени или с естествена съставка за гризачи (TD 8728C; Harlan Teklad, Madison, WI) или с пречистена съставка AIN-93G (TD 94045; Harlan Teklad). Пречистената диета AIN-93G е избрана, тъй като тя е стандартна диета, която отговаря на хранителните препоръки на Националния съвет за изследвания (23) и е одобрена за растящи, бременни и кърмещи гризачи. Диетата с чау (TD 8728C) е избрана, тъй като съдържа соя, богат източник на фитоестрогени, но в противен случай подпомага растежа, поддържането и размножаването. Предлагат се диети под формата на прах, за да се сведе до минимум замърсяването на урината по време на периодите на метаболитно събиране. По време на проучването се осигуряват диета и вода по желание.

Експериментален дизайн. Преди проучването животните се аклиматизират в продължение на 7 дни. След аклиматизацията, естрозните цикли на плъхове бяха проследени в продължение на 20 дни чрез извършване на ежедневни вагинални цитонамазки. Това позволи да се наблюдават четири естрозни цикъла с нормална дължина (4-5 дни). Използвани са само плъхове с редовни естроални цикли. Плъховете на възраст 77 дни бяха разпределени на случаен принцип (н = 9-11/група), за да се съхранява като амбулаторен контрол (AMB) или да се подлага на HLS съгласно процедурата на Morey-Holton (21). Избран е експериментален период от 38 дни (~ 8 естрозни цикъла), за да се изследва ефекта на HLS върху репродуктивната функция. AMB контролът и HLS животните се поддържат в HLS/метаболитни клетки, разположени в една и съща стая, за да се осигурят еднакви условия на настаняване и среда. Ежедневни вагинални цитонамазки се получават от животни през целия експериментален период. Телесната маса, приема на храна и консумацията на вода се измерват два пъти седмично.

В края на 38-дневния експериментален период плъхове (н = 9-11 плъхове/група) бяха евтаназирани и след това дисектирани. Дисекциите започват в 8:30 ч. И приключват в 11:00 ч., За да се сведат до минимум дневните вариации в хормоните. В 8:00 ч. Сутринта на дисекцията бяха направени вагинални цитонамазки. За да се избегнат циклични колебания в хормоните, само плъхове, определени за еструс, са евтаназирани и дисектирани. Дисекциите настъпиха в продължение на 4 дни, за да позволят на плъхове, които не бяха в еструса, да влязат в еструса. В случаите, когато това не беше осъществимо поради продължителна диестра, животните бяха евтаназирани и дисектирани, но теглото на репродуктивните им органи и нивата на хормоните бяха изключени от анализа. Животните бяха анестезирани с изофлуран, обезкървени чрез сърдечна пункция и след това обезглавени. Кръв се събира за определяне на нивата на лутеинизиращ хормон (LH), фоликулостимулиращ хормон (FSH), естрадиол, прогестерон и кортикостерон (CORT). Репродуктивните и основните органи бяха изрязани, подрязани, попити и претеглени.

Оценка на естроусов цикъл. Правени са ежедневни вагинални цитонамазки (4). Накратко, върхът на навлажнен с физиологичен разтвор памучен тампон внимателно се въвежда във влагалището, като се внимава да не се постави на дълбочина> 1,0 cm; в противен случай псевдобременността може да е била стимулирана при плъхове. Намазката се прехвърля върху предметно стъкло на микроскоп и се изследва под светлинен микроскоп (× 20), за да се определи етапът на естрозния цикъл. Етапите на естрозния цикъл се определят по метода на Еверет (10). Естрозните етапи на цикъла са 1) proestrus (главно епителни клетки), 2) еструс (главно рогови клетки), 3) метеструс (роговици и левкоцикти), и 4) диеструс (главно левкоцити). Нормалният еструсен цикъл при плъхове се определя като 4-5 дни. Циклите се считат за удължени, ако плъхът остава в една фаза за> 3 дни и ацикличен, ако плъхът остава в една фаза за> 15 дни.

Измерване на CORT на урината. Проектираната от НАСА клетка HLS също функционира като метаболитна клетка (14). Ежедневни 24-часови проби от урина се събират, за да се отчетат дневните вариации в нивата на CORT. Петдневни, 24-часови проби от урина бяха събрани, за да се вземат предвид хормоналните колебания, възникващи по време на естрозния цикъл. Обемът на урината и пробите бяха събрани в три времеви точки: изходно ниво (т.е. преди експериментално), в началото на експеримента и в края на експерименталния период. Декалиново масло (1 ml) се добавя към епруветките на урината преди събиране, за да се предотврати изпаряването. Събраните 24-часови проби от урина се центрофугират при 1500 ж за 10 минути при 4 ° С. След центифугиране, пробите от урина се разпределят в аликвотни части в свежи епруветки и се държат замразени при -20 ° C, докато се изследват CORT и креатинин. Концентрацията на креатинин в урината беше измерена с помощта на автоматизирана аналитична система (COBAS; Roche Diagnostic Systems, Somerville, NJ).

Нивата на CORT в урината са определени съгласно Ortiz et al. (26). Накратко, за да се определят нивата на CORT в урината, се екстрахира аликвотна част от 250 μl, използвайки 1: 1 дихлорометан. След екстракция, пробите от урина бяха възстановени 1:20, като се използва стероиден разредител и ниво на CORT в урината, определено от предлагания в търговската мрежа комплект CORT ImmunChem с двойно антитяло за радиоимуноанализ (RIA) (ICN Biomedicals, Коста Меса, Калифорния). Преброяването на радиоизотопите беше извършено с помощта на брояч на Cobra II Auto-Gamma (Packard BioScience, Downers Grove, IL). Всички проби бяха измерени в два екземпляра. Коефициентите на вариация на интра- и интрасай за CORT в урината са съответно 3,6 и 4,3%.

Измервания на плазмен хормон. Кръвни проби бяха получени от плъхове при дисекция. Животните бяха анестезирани с изофлуран и след това обезкървени чрез сърдечна пункция. Кръвта се събира в епруветки, съдържащи хепарин, и се държи върху лед. Събраните кръвни проби се центрофугират при 1500 ж за 10 минути при 4 ° C за отделяне на плазмата. Плазмените проби се събират и съхраняват при -80 ° C, докато се анализират хормоните на хипофизата, репродукцията и стреса. Наличните в търговската мрежа Coat-a-Count (Diagnostic Products, Los Angeles, CA) RIA комплекти са използвани за измерване на плазмените концентрации на естрадиол и прогестерон. Плазмените LH и FSH се определят чрез комплект RIA с двойно антитяло (Amersham, Arlington Heights, IL). За определяне на плазмените нива на CORT са използвани комплекти RIA с двойни антитела ImmunChem (ICN Biomedicals). Коефициентите на вариация в рамките на интра- и интрасаса са 6,2 и 7,5% за естрадиол, 4,3 и 6,3% за прогестерон, 3,7 и 5,4% за LH, 6,7 и 7,3% за FSH и 5,0 и 5,3% за CORT, съответно.

Измервания на хипофизен хормон. Хипофизната жлеза се дисектира и предната хипофиза се отделя от нервния лоб, претегля се и се замразява при -80 ° C, докато се изследва. За да се определят нивата на LH и FSH на хипофизата, всяка предна хипофиза се хомогенизира в 1 ml ледено студен фосфатен буфер (0,025 М, рН 7,5, съдържащ 0,1% тегл./Об. Натриев азид). Хомогенатът се центрофугира при 1500 ж за 10 минути при 4 ° С. Супернатантът, получен след центрофугиране, се разрежда 1: 320 в ледено студен фосфатен буфер. LH и FSH на хипофизата се определят чрез комплект RIA с двойно антитяло (Amersham). Коефициентите на вариация в рамките на интра- и интрасаса са съответно 6,2 и 7,5% за LH на хипофизата и 3,0 и 4,1% за FSH, съответно.

Тегла на органите. При дисекция органите бяха изрязани, подрязани, попити и претеглени. Матката, яйчниците и предната част на хипофизата са претеглени като репродуктивни индекси. Надбъбречните жлези са претеглени като индикатор за хроничен стрес. Основните органи, т.е. мозък, черен дроб и бъбреци, също бяха претеглени.

Статистически анализ. CORT в урината се изчислява като ниво на хормона, умножено по 24-часов обем урина, разделено на скоростта на екскреция на креатинин. Всички статистически анализи бяха направени с помощта на StatView (Abacus Concepts, Berkeley, CA). Еднопосочен ANOVA е използван за определяне на разликите между лечебните групи. Използва се двупосочна ANOVA за определяне на разликите поради диета, лечение на HLS или диета по време на лечение на HLS. Многократни сравнителни тестове бяха извършени с помощта на теста на Tukey. Разликите бяха счетени за значителни при P

диетата

Фиг. 1.Ефект от диетата и/или излагането на суспензия на задните крайници (HLS) върху телесната маса през 38-дневния експериментален период. AMB/AIN-93G, амбулаторни (AMB) плъхове, хранени с диета на Американския институт по хранене (AIN) -93G; AMB/Chow, AMB плъхове, хранени с диу чау; HLS/AIN-93G, HLS плъхове, хранени с AIN-93G диета; HLS/Chow, HLS плъхове, хранени с диу чау. Стойностите са средни стойности ± SE; н = 9-11 плъхове/група. Различните букви показват значителни разлики при P

Естроусни цикли. След 7-дневна аклимация, естросните цикли се определят ежедневно за 20-дневен предекспериментален период. При плъховете, хранени с AIN-93G, средната продължителност на естросния цикъл (4,7 ± 0,4 дни) не се различава значително от животните, хранени с чау (4,6 ± 0,4 дни). Въпреки това, един плъх в групата, хранена с чау, е бил ацикличен, индикиран от персистиращи еструси (т.е. рогови клетки във вагинална цитология) в продължение на 20 дни и е бил изключен от експеримента. В 38-дневния експеримент са използвани само плъхове, за които е определено да карат нормално (4-5 дни).

HLS увеличи средната средна продължителност на цикъла в сравнение с контролните плъхове на AMB (фиг. 2). Двупосочен ANOVA показва ефект на лечение с HLS (P = 0,002), но няма диета или диета по време на лечението с HLS ефект върху продължителността на естроуса. Фигура 3 показва процента на плъхове с нормални (4-5 дни) естрозни цикли/цикли по време на 38-дневния HLS. По време на първоначалния 5-дневен HLS (цикъл 1), процентът на нормално колоездещите плъхове намалява в сравнение с плъховете AMB. Въпреки това, естрозният цикъл след адаптация към HLS (цикъл 2) показа, че плъховете се връщат към нормалното колоездене. От цикли 3 и 4 (дни 15-20 HLS), HLS плъховете показват по-голям процент животни с удължени цикли на еструс в сравнение с AMB плъхове.

Фиг. 2.Ефект от диетата и/или излагането на HLS върху средната продължителност на естросния цикъл. Стойностите са средни стойности ± SE; н = 9-11 плъхове/група. Различните букви показват значителни разлики при P

Фиг. 3.Ефект от диетата и/или излагането на HLS върху процента женски плъхове, показващи нормално колоездене при всеки цикъл по време на 38-дневния HLS. Стойностите са проценти женски плъхове с нормални естроални цикли (4-5 дни)/цикъл.

Плъховете, подложени на HLS, имат удължени цикли поради продължителни диеструси, т.е. общ брой дни в диеструсите през 38-дневния експериментален период (фиг. 4). HLS плъховете също демонстрират намалено време, прекарано в еструса; това обаче се е случило само при плъхове, хранени с AIN-93G, а не при плъхове, хранени с диета с чау. Двупосочният ANOVA за времето, прекарано в диеструс или еструс, показва диета, умножена по отношение на ефекта от лечението с HLS (P

Фиг. 4.Ефект на диетата и/или излагането на HLS върху общото време, прекарано във всяка фаза на естросния цикъл през 38-дневния експериментален период. Стойностите са средни стойности ± SE; н = 9-11 плъхове/група. Различните букви показват значителни разлики при P

УРИНЕН КОРТ. CORT на урината се събира на изходно ниво (преди експериментално), по време на първоначалната HLS и в края на експеримента. Фигура 5 показва, че изходният CORT в урината е значително по-висок при плъхове, хранени с чау, в сравнение с животни, хранени с AIN-93G, което показва диетичен ефект. Първоначалният HLS води до повишени нива на CORT в урината в сравнение с контролите на AMB, без значителни разлики между плъхове, хранени нито с чау, нито с AIN-93G диета. Двупосочен ANOVA показва ефект на лечение с HLS (P

Фиг. 5.Ефект от диетата и/или излагане на HLS върху 5-дневен пикочен кортикостерон/креатинин. Стойностите са средни стойности ± SE; н = 9-11 плъхове/група. Различните букви показват значителни разлики при P

Фиг. 6.Ефект от диетата и/или излагането на HLS върху 24-часовия кортикостерон/креатинин в урината, събрани през първите 5 дни на HLS. Стойностите са средни стойности ± SE; н = 9-11 плъхове/група. Различните букви показват значителни разлики при P

Плазмени и хипофизни хормони. Плазмените нива на естрадиол са значително по-ниски при плъхове HLS/AIN-93G в сравнение с плъхове AMB/AIN-93G (Таблица 1). Няма значим ефект от диетата, лечението с HLS или диетата по време на лечението с HLS върху плазмения прогестерон или нивата на LH или FSH в плазмата и хипофизата (Таблица 1). Нивата на CORT в плазмата са значително по-високи при HLS/Chow, отколкото при плъхове AMB/AIN-93G (Таблица 1). Наблюдава се тенденция на повишени нива на CORT в плазмата при плъхове, хранени с AW-93G и при плъхове HLS срещу AMB.

маса 1. Ефект от диетата и/или излагането на суспензия на задните крайници върху хормоните на плазмата и хипофизата

Стойностите са средни стойности ± SE; н = 7-11 плъхове/група. AMB/AIN-93G, амбулаторни (AMB) плъхове, хранени с диета на Американския институт по хранене (AIN) -93G; AMB/Chow, AMB плъхове, хранени с диу чау; HLS/AIN-93G, окачени на задните крайници (HLS) плъхове, хранени с AIN-93G диета; HLS/Chow, HLS плъхове, хранени с диу чау. Различните символи в една и съща колона показват значителни разлики при P

Таблица 2. Ефект от диетата и/или излагането на суспензия на задните крайници върху теглото на органите