Шакир М. Сауд

1 Група за научни изследвания в областта на храненето, Национален институт по рака, Отдел за превенция на рака, Rockville, MD

2 Лаборатория за профилактика на рака, Център за изследване на рака, Национален институт по рака, Фредерик, д-р

Матю Р. Йънг

2 Лаборатория за профилактика на рака, Център за изследване на рака, Национален институт по рака, Фредерик, д-р

Ява Л. Джоунс-Хол

3 Университетски колеж Purdue по ветеринарна медицина, Отдел за сравнителна патобиология, West Lafayette, IN

Лилия Илева

4 Програма за изобразяване на малки животни, SAIC-Frederick, Frederick MD

Моисей О. Евбуомван

5 Лаборатория по патология, Център за изследване на рака, Национален институт по рака, Bethesda, MD

Дженифър Уайз

6 Лаборатория по животновъдни науки, SAIC-Фредерик, Фредерик д-р

Нанси Х. Колбърн

2 Лаборатория за профилактика на рака, Център за изследване на рака, Национален институт по рака, Фредерик, д-р

Младият С. Ким

1 Група за научни изследвания в областта на храненето, Национален институт по рака, Отдел за превенция на рака, Rockville, MD

Герд Боб

7 Институт Линус Полинг, Държавен университет в Орегон, Корвалис, Орегон

8 Департамент по науките за животните и пасищата, Държавен университет в Орегон, Корвалис, Орегон

Свързани данни

Резюме

Въведение

Колоректалният рак (CRC) е четвъртият най-често диагностициран вид рак в Съединените щати и е втората водеща причина за смъртни случаи, свързани с рака (1). Хроничното възпаление, като улцерозен колит и болест на Crohn, са свързани с повишен риск от CRC (2–5).

Семейството на тирозин киназите Src (SFK) са нерецепторни протеинови тирозин кинази (TK), които се активират при множество видове рак, включително CRC (6). Повишената активност на Src в първичната CRC е индикатор за лоша прогноза (7). С-терминалната Src киназа, известна още като c-Src киназа (CSK), регулира отрицателно SFK чрез фосфорилиране на С-терминален тирозин (Y530 в c-Src) (8). С-терминалното фосфорилиране на SFK стабилизира протеина в инхибиторно потвърждение, което предотвратява автофосфорилирането на активационната верига тирозин (Y419 в c-Src). Подобната на рецептор тирозин фосфатаза CD45 и подобни фосфастази налагат реципрочно регулиране на Src чрез отстраняване на С-крайния тирозин фосфат (9).

Активираният Src може да регулира много пътища надолу по веригата, включително фосфатидилинозитол 3-киназа (PI3-K), Ras-Mek-ERK, STAT3 и p130, за да увеличи преживяемостта, пролиферацията, ангиогенезата, подвижността и инвазията (6). Активираният Src може също да фосфорилира β-катенин, причинявайки освобождаването му от секвестрацията на Е-кадхерин в плазмената мембрана и подобрявайки ядрената му локализация (10). Колоректалният рак изглежда чувствителен към загуба на регулация на Src. Загубата на експресия на отрицателния регулатор CSK и свръхекспресията на Src са замесени в колоректалната канцерогенеза (8).

Разходите за лечение на КРС се оценяват на 6,5 милиарда долара годишно (11). Промяната в диетата и употребата на хранителни добавки, както осъществими, така и безопасни, представлява жизнеспособна и важна стратегия за предотвратяване на КРС (12). Неотдавнашен анализ на клиничното изпитване за превенция на полипи (PPT), изследващо ролята на модулацията на диетата в превенцията на рецидив на колоректален аденом, предполага, че консумацията на богата на изорамнетин диета е свързана с намален риск от напреднал рецидив на аденом (13).

Наскоро беше показано, че изорамнетин може да потисне рака на кожата чрез свързване и инхибиране на MAP (митоген-активиран протеин)/ERK (извънклетъчен сигнал регулирана киназа) киназа (MEK) 1 и PI3-K (фосфоинозитид 3-киназа) (14). За по-нататъшно изследване на потенциалната роля на флавонолите в превенцията на CRC, ние оценихме ефектите на 4 флавоноли, често консумирани от хората, изорамнетин, кверцетин, рутин и мирицетин, в миши модел за CRC. Установихме, че допълването на диетата с изорамнетин значително намалява колоректалната туморогенеза при тези мишки. Изглежда, че диетата с изорамнетин разрешава възпалението, предизвикано от DSS, измерено чрез ядрено-магнитен резонанс (MRI), хистопатология и имунохистохимия (IHC). Изорамнетин също инхибира Src активността и ядрената локализация на β-катенин и повишена експресия на CSK както in vivo, така и в клетките на колоректалния карцином. И накрая, ние показахме, че инхибирането на Src и ядрения β-катенин зависи от повишената регулация на CSK в раковите клетки на дебелото черво и е свързано с експресията на CSK в мишки, хранени с изорхамнетин.

Материали и методи

Изследвания върху животни

растителния

Изорамнетин намалява AOM/DSS-индуцираната колоректална туморогенеза. A, Времева линия, показваща, че мишките са били лекувани с AOM на ден 0 и с 2% DSS от ден 7 до 14. На ден 17, мишките са били блокирани от загуба на тегло и произволно стартирани в рамките на блокове с тегло на експериментални диети. На 20, 25 и 33 ден мишки са изобразени с помощта на ЯМР и един ден по-късно те са евтаназирани и тъкани събрани. По-късно (ден 59 и 102) мишките бяха евтаназирани и тъканите бяха събрани без ЯМР. B-D, Анализ на колоректуми, събрани на ден 102. B, Туморни числа на мишка (геометрична средна ± стандартна грешка). C, Натоварване на тумора в mm 3/мишка (геометрична средна ± стандартна грешка). D, Размер на тумора в mm 3/тумор (геометрична средна ± стандартна грешка). Ct показва контролна диета N = 13, IsR показва изорамнетинова диета N = 12.

Хистопатология

Тъканите на дебелото черво се събират от мишки по различно време след третиране с AOM или AOM DSS и се фиксират в 4% формалдехид за една нощ и се съхраняват в 70% етанол. Фиксираните участъци от тъкани на дебелото черво се вграждат в парафин, нарязват се на 6-μm участъци и се поставят върху микроскопични диапозитиви от Histoserv Inc. (Germantown, MD, USA). Слайдовете бяха или оцветени с хематоксилин-еозин (H&E) за хистологичен анализ чрез светлинна микроскопия или депарафинизирани в ксилол и рехидратирани в степенуван етанол за IHC. За хистопатологичен анализ се прави оценка на приблизително 5 mm дълъг участък на дисталното дебело черво за всяко животно. Тъканите бяха заслепени и оценени от патолога полуколичествено от 0 до 15, както е описано (допълнителна таблица 2). Дебелото черво се изследва, започвайки от колоректалната връзка и продължавайки адорално на 5 mm до средното дебело черво. Накратко, тежестта на левкоцитния инфилтрат в лигавицата беше субективно оценена като лека, умерена или тежка (съответно 1, 2, 3); разпределението беше оценено и обозначено като фокално/локално обширно, мултифокално или дифузно (съответно 1, 2, 3); и дълбочината беше оценена и обозначена само като лигавица, простира се до субмукозата и се простира до мускулната мукоза или серозата (съответно 1, 2, 3). Разпределението на атипичната жлезиста хиперплазия (AGH)/сквамозната (sq) метаплазия се оценява като фокална, мултифокална или дифузна (съответно 1, 2, 3). Разпределението на язвата се оценява като фокално, мултифокално или дифузно (съответно 1, 2, 3). Ако е налице некроза, тя субективно се оценява като лека, умерена или тежка и се оценява съответно (съответно 1, 2, 3). За всеки критерий, който не е представен в секцията, беше присвоен резултат 0, какъвто беше случаят с повечето мишки за язви и некроза. Общият резултат на заболяването на мишка се изчислява чрез сумиране на шестте параметъра за всяка мишка.

Имунохистохимия

За имунохистохимия срезовете бяха поставени в модифициран с ниско рН цитратен буфер (Dako, Carpinteria, CA, USA) и подложени на извличане на антиген чрез камера под налягане. Срезите бяха предварително инкубирани в 3% H2O2 за 20 минути и блокирани в нормален кози серум за 1 час. Секциите се инкубират цяла нощ в разтвор на първично антитяло, разреден, както следва; Ki-67, фосфо β-катенин 654 (лаборатории Abcam, Кеймбридж, Масачузетс, САЩ) 1:50, CD45 (BD biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) 1:50, pSrc Y417 и β-катенин (клетъчна сигнализация, Danvers, Масачузетс, САЩ) 1: 100 и 1: 1000, съответно. Слайдовете се инкубират в продължение на 1 час в конюгирано с биотин вторично антитяло, разредено 1: 200. Секциите бяха третирани с комплект Vectorstain ABC (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA); получената активност се открива с диаминобензидин (Sigma, Сейнт Луис, Мичиган, САЩ) и се оцветява в хематоксилин. За CSK (Abcam Laboratories, Кеймбридж, Масачузетс) тъканите се инкубират 1:50 за 1 час и се откриват с Ventana iView DAB комплект за откриване (Ventana Medical Systems, Oro Valley, AZ, USA) на Ventana BenchMark.

Клетъчна култура

Клетъчната линия HT29 на човешкия рак на дебелото черво е получена от American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) и е култивирана, както е описано по-горе (16).

Уестърн петно

Клетките HT29 бяха засяти върху 100 mm плаки и третирани с DMSO носител (417 (1: 1000), pSRC 529 (1: 1000), β-катенин (1: 2000), pAKT (1: 1000), pERK (1: 2000 ), E-Cadherin (1: 1000) и pGSK3αβ (1: 1000) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) и pβ-catenin 654 (Abcam laboratories, Cambridge, MA, USA) през нощта при 4 ° C, последвани чрез инкубация в HRP, белязани Вторични антитела за 1 час. Клетките са разработени с SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) .Всяка мембрана е сондирана с β-Actin (1: 5000, Sigma, St. Louis, MI, САЩ), за да се осигури последователно натоварване с протеин.

PCR в реално време

Общата РНК от култивирани клетки НТ29 се изолира, като се използва метод на екстракция на РНК Trizol. Накратко към пробата се добавя хлороформ и след разклащане и центрофугиране се изолира водният слой. След това към пробата се добавя изопропанол за утаяване на РНК. След центрофугиране РНК пелетата се промива със 70% етанол. По-нататък РНК се пречиства, като се използва комплект RNeasy (QIAGEN, Germantown, MD, USA). CDNA беше синтезирана с помощта на Bio-Rad iScript обратна транскриптаза и PCR реакциите бяха проведени с помощта на Bio-Rad SYBR Green Master Mix, проведено в Bio-Rad iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Човешки CSK сплайсинг варианти 1 и 2 са закупени от IDT (Сан Хосе, Калифорния, САЩ) и последователността е както следва: смисъл, 5′-TCCGGCCCCGTCTCTCTTGG и антисенс, 5′-ACCCTCACGGGCAGGACAGG. PCR включва контрола без шаблон и GAPDH като контролен набор от праймери. Нивото на активност на CSK транскрипт се изчислява, като се използва 2 Δ (ΔCT), където ΔCT = CTCSK-CTGAPDH и Δ (ΔCTstimulated -ΔCTcontrol).

CSK siRNA конструкция

Клетките HT29 бяха стабилно трансфектирани с 3 уникални 27mer siRNA дуплекси - по 2 nmol всеки срещу CSK siRNA (Trilencer-27, Origene technology, Rockville, MD, USA) или разбъркана контролна siRNA, като се използва реагент на производителя за трансфекция и препоръки. След трансфекцията клетките се инкубират в продължение на 36 часа. Общият протеин се изолира и се подлага на Western blot анализ.

Анализ на мек агар

маса 1

Ефект от храненето на флавоноли при еквимоларни концентрации (ppm) в продължение на 85 дни върху AOM/DSS-индуцирани мъжки FVB мишки върху заболеваемостта, броя на туморите и туморната тежест (N = 32 на група)