Отделение за клинична микробиология и имунология, Асоциирана болница на Медицински колеж Гуиянг, Гуянг, провинция Гуейджоу, Китай

добавка

Отделение по инфекциозни болести, Асоциирана болница на Медицински колеж Гуиянг, Гуянг, провинция Гуейджоу, Китай

Отделение по инфекциозни болести, Асоциирана болница на Медицински колеж Гуиянг, Гуянг, провинция Гуейджоу, Китай

Принадлежност Академия на науките Гуйджоу, Гуйянг, провинция Гуейджоу, Китай

Отделение за клинична микробиология и имунология, Асоциирана болница на Медицински колеж Гуиянг, Гуянг, провинция Гуейджоу, Китай

  • Юпинг Уанг,
  • Минглианг Ченг,
  • Баофанг Джанг,
  • Фей Ни,
  • Хонгмей Дзян

Фигури

Резюме

Да се ​​изследва ефектът от приема на сок от боровинки върху фиброзата на черния дроб на плъх и влиянието му върху защитата на черния дроб срещу антиоксиданти.

Методи

Rabbiteye боровинка се използва за приготвяне на пресен сок за хранене на плъхове чрез ежедневна стомашна сонда. Капсулата Dan-shao-hua-xian (DSHX) се използва като положителна контрола за защита на чернодробната фиброза. Чернодробна фиброза се предизвиква при мъжки плъхове Sprague-Dawley чрез подкожно инжектиране на CCl4 и хранене с високо липидна/нискобелтъчна диета в продължение на 8 седмици. Чернодробната фиброза се оценява чрез оцветяване на Masson. Експресията на α-гладкомускулен актин (α-SMA) и колаген III (Col III) се определя чрез имунохистохимични техники. Определени са дейностите на супероксиддисмутаза (SOD) и малондиалдехид (MDA) в чернодробните хомогенати. Експресията на металотионеин (МТ) се открива чрез RT-PCR в реално време и имунохистохимични техники.

Резултати

Консумацията на сок от боровинки значително намалява индуцираната от CCl4 чернодробна фиброза на плъхове, която е свързана с повишена експресия на металотиоин (MT), повишена активност на SOD, намален оксидативен стрес и намалени нива на α-SMA и Col III в черния дроб.

Заключение

Нашето проучване предполага, че хранителните добавки със сок от боровинки могат да увеличат антиоксидантната способност на черния дроб, вероятно чрез стимулиране на експресията на МТ и активността на SOD, което от своя страна насърчава инактивирането на HSC и по този начин намалява натрупването на колаген в извънклетъчния матрикс в черния дроб и по този начин облекчава чернодробната фиброза.

Цитат: Wang Y, Cheng M, Zhang B, Nie F, Jiang H (2013) Диетичната добавка на сок от боровинки подобрява чернодробната експресия на металотионеин и отслабва чернодробната фиброза при плъхове. PLoS ONE 8 (3): e58659. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058659

Редактор: Парта Мукопадхяй, Национален здравен институт, Съединени американски щати

Получено: 19 октомври 2012 г .; Прието: 5 февруари 2013 г .; Публикувано: 12 март 2013 г.

Финансиране: Това проучване беше подкрепено с грант от Министерството на науката и технологиите на провинция Гуейджоу за модернизация на традиционната китайска медицина (грант № ZY [2012] 3017), грант от Фондацията на губернатора на провинция Гуйджоу ([2012] 44) и грант от Националната фондация за образователни екипи на Китай ([2009] 12). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Чернодробната фиброза е възстановителен отговор при хронично увреждане на черния дроб [1]. Това е прогресиращ патологичен процес и често срещана патологична промяна при хронични чернодробни заболявания. Оксидативният стрес е важен патогенен фактор за много чернодробни заболявания, който може да причини увреждане на хепатоцитите чрез липидна пероксидация и протеиново алкилиране [2] - [5]. Супероксиддисмутазата (SOD) и каталазата са важни антиоксидантни ензими, които функционират като ендогенни чистачи на свободни радикали. Наскоро металотионеинът (MT) беше идентифициран като по-ефективен чистач за реактивни кислородни видове (ROS) [6]. Има две основни изоформи на МТ, Mt-1 и Mt-2, които са разпространени повсеместно в почти всички тъкани [7]. Интересното е, че MT беше показано, че може да засили активността на SOD in vitro [8]. Доказано е, че сърдечната свръхекспресия на МТ ефективно отслабва диабетната кардиомиопатия чрез потискане на производството на реактивни кислородни видове (ROS) и оксидативен стрес [9]. Понастоящем няма налични ефективни лекарства за профилактика или лечение на чернодробна фиброза, а някои естествени вещества с антиоксидантни свойства се разследват за разработване на нови терапевтични реактиви.

Боровинките са многогодишни цъфтящи растения, принадлежащи към Vaccinium spp. от семейство Ericaceae. През последните години Изследователският център за човешко хранене в Съединените щати проведе поредица от проучвания, демонстрирайки, че боровинката съдържа високо ниво на антоцианини и изглежда има най-високата антиоксидантна способност сред плодовете и зеленчуците [10], [11]. Доказано е, че боровинките и пробиотиците имат защитни ефекти при остро увреждане на черния дроб, предизвикано от d-галактозамин и липополизахарид [12]. Проантоцианидин, изолиран от листа от боровинки, е в състояние да инхибира репликацията на вируса на хепатит-c (HCV) [13]. Освен това, проантоцианидин, получен от листата на Vaccinium virgatum, потиска индуцираната от тромбоцитите фактор на растежен фактор, пролиферация на човешката чернодробна звездна клетъчна линия LI90 [14]. Увеличаването на консумацията на боровинки изглежда практична и ефективна стратегия за намаляване на оксидативния стрес и по този начин защита на нараняванията на тъканите [15].

Целта на тази изследователска работа е да се изследва ефектът на боровиновия сок върху индуцираната от CCl4 фиброза на черния дроб на плъх и неговите ефекти върху чернодробните нива на ендогенните антиоксидантни компоненти.

Материали и методи

Реактиви и третиране на животни

„Rabbiteye Blueberry“ е произведено от Академията на науките в Гуйджоу в полето за производство на боровинки в Ma-Jiang, Гуейджоу, Китай. Боровинката се съхранява при -20 ° C до експериментална употреба. Пресният сок от боровинки се приготвя чрез хомогенизиране на замразените плодове непосредствено преди началото на експериментите (1 ml сок от боровинки съдържа около 2 g суха боровинка). Основните активни съставки на боровиновия сок бяха анализирани чрез HPLC-DAD и NBT методи и показани в Таблица 1. Капсули Dan-shao-hua-xian (DSHX), съставени от пет китайски билкови лекарства-Tetrandrine, Radix Salviae Miltiorrhizae, Radix Paeoniae Rubra, Astragalus Membranaceus и Ginkgleaf са закупени от фармацевтичната компания Guiyang (Гуейджоу, Китай, номер на партида 20081011). По-рано съобщихме, че DSHX е ефективен за предотвратяване на чернодробна фиброза [16] и следователно е послужил като положителен контрол за защита на чернодробната фиброза.

Всички проучвания върху животни са били в съответствие с Насоките за грижи и употреба на животните на Медицинския колеж Guiyang (Guiyang, Китай).

Хистопатология и измерване на серумните нива на AST

След фиксиране в 10% формалин за 24 часа, чернодробните проби бяха вградени в парафин. След това пробите се нарязват на парчета от 5 µm и се монтират върху предметни стъкла. След това те бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) за хистопатологично изследване и със специфично за фиброза оцветяване на Masson за оценка на степента на чернодробна фиброза. Хистологичната оценка е извършена два пъти от двама патолози, заслепени от протокола, върху пет полета с малка мощност на предмет. Модифицираната система за оценка на Ishak беше използвана с незначителни промени, за да се определи степента на фиброза [18].

Концентрациите на серумен AST се измерват с автоматичен биохимичен аналитичен инструмент (Siemens Advia 1650, Bensheim, Германия).

Имунохистохимичен анализ

След депарафинизация, рехидратация и демаскиране на антиген чрез термична обработка чернодробните срези се инкубират в 3% H2O2 в продължение на 10 минути. След това те бяха инкубирани с анти-α-SMA (SC-32251, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-Col III (SC-80564, Santa Cruz Biotechnology) и anti-MT (sc-11377, Santa Cruz Biotechnology) антитяло (1∶100) за една нощ при 4 ° C. След това пробите бяха обработени с помощта на комплект EnVision (номер на партида 10N1775A, Dako, Дания) съгласно протоколите на производителя. Буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) се използва като отрицателна контрола. Клетките с кафяво оцветяване в цитоплазмата/ядрото се считат за положителни. Пет микроскопични полета с висока мощност (увеличение 400 пъти) бяха избрани на случаен принцип за слайд и беше отчетен броят на положителните клетки на поле (α-SMA и MT имунопозитивност). За оцветяване с Col III във всяка секция бяха избрани произволно 5 полета с висока мощност и изображенията бяха анализирани от Biomias2000 Image Analytic Instrument, за да се определи количествено прозрачността на имуноположителните области в секцията (данни, изразени като оптична плътност (OD), която е обратна пропорционално на интензивността на имунооцветяващите сигнали).

Анализ на верижна реакция с обратна транскриптаза-полимераза в реално време (RT-PCR)

Общата РНК беше извлечена от чернодробни тъкани с реактив Trizol (партиден номер 13827390, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) съгласно инструкциите на производителя. Пробите от РНК са използвани за обратна транскрипция с праймери за обратна транскриптаза и олиго (dT) на вируса на миша левкемия на Молони (MMuLV) (партиден номер 00033699, Fermentas, MBI, Burlington, ON, Канада). Комплектът SYBR Green DNA PCR (номер на партида 0804104, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) беше използван за RT-PCR анализ в реално време. PCR праймерите са доставени от д-р Jie Liu (Университетът в Канзас, медицински център, САЩ). Последователностите на праймерите са както следва. MT-I нагоре по веригата 5′-TGTGCCTGAAGTGACGAACAG-3 ′, надолу по веригата 5′-TTCACATGCTCGGTAGAAAACG-3 ′; Бета-актин нагоре по веригата 5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3 ′, надолу по веригата 5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGAA-3 ′ .

Стойностите на времето на цикъла (Ct) на гените, които представляват интерес, се нормализират с β-актин от същата проба. Относителните разлики между групите бяха изчислени и изразени като относителни увеличения, като контролата беше зададена на 100%.

Измерване на нивата на SOD и MDA в чернодробните хомогенати

Чернодробните хомогенати се приготвят с помощта на замразени чернодробни тъкани. Съдържанието на SOD се определя по метода на ксантиноксидазата и съдържанието на MDA се тества по метода на тиобарбитуровата киселина в съответствие с инструкциите на производителя (съответно номера на партиди 20090615, 20090616; Jiancheng Biologic Company, Nanjing, Китай).

Статистически анализ

Анализът на данните се извършва с помощта на софтуера SPSS 11.5 (Чикаго, IL, САЩ). Количествените данни бяха изразени като средно ± SD и подложени на еднопосочен дисперсионен анализ, последван от Post Test на Tukey за множество сравнения. Обикновените данни бяха анализирани чрез анализ на Radit. P Фигура 1. Ефект на боровиновия сок върху индуцирана от CCl4 чернодробна фиброза и увреждане на черния дроб.

Чернодробна фиброза се предизвиква при плъхове чрез подкожно инжектиране на CCl4 и впоследствие хранене с високо липидна/нискобелтъчна диета в продължение на 8 седмици със или без ежедневна сонда от боровинки. След 8 седмици степента на чернодробна фиброза беше оценена чрез оцветяване на Masson. Изображения на горния панел показват репрезентативни чернодробни хистологични промени в черния дроб на нормалната контролна група (A), CCl4-индуцирана група на чернодробна фиброза (моделната група, Б.), група за превенция на сок от боровинки (BB група, ° С), Група за превенция на капсули Dan-shao-hua-xian (група DSHX, д) и сок от боровинки + група за превенция DSHX (група BB + DSHX, Е.), Оригинално увеличение 100 ×, стрелките показват колагенови влакна. Долният панел илюстрира серумни нива на аспартат аминотрансфераза (AST) в петте групи плъхове, както е посочено. * p Фигура 2. Ефект на боровиновия сок върху експресията на α-SMA протеин в черния дроб на плъхове.

Същите групи плъхове бяха третирани, както е описано на Фигура 1. Изображения на горния панел показват репрезентативно чернодробно оцветяване на α-SMA IHC в нормалната контролна група (A), CCl4-индуцирана група на чернодробна фиброза (моделната група, Б.), група за превенция на сок от боровинки (BB група, ° С), Група за превенция на капсули Dan-shao-hua-xian (група DSHX, д) и сок от боровинки + група за предотвратяване на DSHX (BB + DSHXgroup, Е.). Оригинално увеличение 400 ×, стрелките показват положително цитоплазматично оцветяване. Долният панел показва количествените данни за оцветяване с α-SMA IHC. * p Фигура 3. Ефект на боровиновия сок върху експресията на протеин Col III в черния дроб на плъхове.

Изображения на горния панел показват репрезентативното оцветяване на чернодробни Col III IHC в нормалната контролна група (A), CCl4-индуцирана група на чернодробна фиброза (моделната група, Б.), група за превенция на сок от боровинки (BB група, ° С), Група за превенция на капсули Dan-shao-hua-xian (група DSHX, д) и сок от боровинки + група за превенция DSHX (група BB + DSHX, Е.). Оригинално увеличение 400 ×, стрелките показват положително цитоплазматично оцветяване. Долният панел показва количествените данни за оцветяване с Col III IHC чрез използване на системата за анализ на изображения Biomias2000, която измерва прозрачността на слайдовете, която е обратно свързана с позитивността на оцветяването с Col III IHC. * p Фигура 4. Ефект на боровиновия сок върху нивата на SOD и MDA в черния дроб.

Чернодробните хомогенати се приготвят, като се използват замразени чернодробни тъкани от плъхове в посочените групи. SOD (A) и MDA (Б.) са измервани нивата в хомогенатите. * p Фигура 5. Ефект на сок от боровинки върху експресията на МТ в черния дроб на плъховете.