Роли Концептуализация, формален анализ, придобиване на финансиране, разследване, администриране на проекти, ресурси, надзор, валидиране, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

органични

Афилиация Американско министерство на земеделието, Служба за земеделски изследвания, Служба за селскостопански изследвания в Южните равнини, College Station, Тексас, Съединени американски щати

Роли Куриране на данни, формален анализ, методология, ресурси, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отделение за науки за животните и храните, Университет в Делауеър, Нюарк, DE, Съединени американски щати

Роли Куриране на данни, формален анализ, писане - преглед и редактиране

Отделение за науки за животните и храните, Университет в Делауеър, Нюарк, DE, Съединени американски щати

Концептуализация на роли, ресурси, писане - преглед и редактиране

Принадлежности DIMEVET, Университет в Болоня, Ozzano Emilia, Болоня, Италия, Vetagro S.p.A., Reggio Emilia, Италия

Концептуализация на роли, ресурси, писане - преглед и редактиране

Принадлежности DIMEVET, Университет в Болоня, Ozzano Emilia, Болоня, Италия, Vetagro Inc., Чикаго, IL, Съединени американски щати

  • Кристина Л. Суагърти,
  • Райън Дж. Арсено,
  • Кейси Джонсън,
  • Андреа Пива,
  • Естер Грили

Фигури

Резюме

Въведение

През последните 10–15 години птицепроизводството ограничи използването на антибиотични стимулатори на растежа (AGP) в птицевъдството [1] и като такова стремежът за намиране на подходящи алтернативи за подобряване на производителността и подобряване на здравето на животните бързо нарасна. До 2025 г. се очаква пазарът на добавки за животни да надхвърли 31 млрд. USD, като птиците са най-големият сектор въз основа на потреблението [2]. Някои примери за продукти, използвани като фуражни добавки за домашни птици, включват: органични киселини, етерични масла, минерали, растителни метаболити, аминокиселини, лечебни билки, олигозахариди и различни хранителни продукти и природни странични продукти [3–7]. В по-голямата си част проучванията на фуражните добавки се фокусират върху производителността или ползите за здравето на животните, без да се обръща внимание на това как добавката работи в гостоприемника, оставяйки пропуск в научните познания.

Анализът на кинома на гостоприемника с пептиден масив предоставя специфични за сайта подробности за протеина, има аналогични биохимични свойства на протеина с пълна дължина и предоставя подробна картина на медиирани от фосфорилирането събития [8], което го прави мощен инструмент за определяне на механизъм (механизми) . Фосфорилирането е най-важното средство за пост-транслационна модификация на протеина и играе ключова роля в почти всички клетъчни сигнални събития и регулиране на основните биологични процеси [9, 10]. Пептидите, представляващи целите, променящи функцията на киназните ензими, осигуряват начин за характеризиране на киномната активност [11]. Разработени са специфични за пилета масиви киноми [12, 13] и са на разположение за анализ на глобалната киназна активност, като предоставят представа за активността, моделите на фосфорилиране, специфичността на субстрата и мутационния статус на специфичен пептид [10]. Освен това масивите от киноми могат да се използват за идентифициране на специфични имунологични или метаболитни пътища, които се активират (или деактивират); следователно, давайки възможност за характеризиране на начина на действие, свързан с фуражната добавка [14].

Материали и методи

Експериментален дизайн и пилета

И за двете експериментални повторения пилетата на контрола (n = 10) и допълнена диета (n = 10) бяха евтаназирани чрез изкълчване на шийката на матката и извадени на 15-дневна възраст. Времето за вземане на проби беше установено въз основа на предишна работа [20, 21] и с оглед на производствения цикъл на бройлери. В търговските условия повечето промени в диетата, преминаващи от закваска към производител, се случват между 10 и 15-дневна възраст. Първите две седмици са много критични за развитието на стомашно-чревната и имунологична функция и до 2 до 3 седмици бройлери се считат за зрели и имат разнообразна микрофлора. При всички експериментални процедури бяха използвани общо 20 пилета на лечение. Парче йеюнум (100 mg) и илеум (100 mg) се събират и изплакват с PBS за отстраняване на чревното съдържание, незабавно се замразяват в течен азот, за да се запази ензимната активност на киназата, и след това се прехвърлят на -80 ° C до по-нататъшен анализ с използване на масив. По отношение на дивертикула на Meckel, пробата от йеюнум е събрана приблизително 10 cm проксимално, а пробата от илеума е събрана приблизително 10 cm дистално. Допълнителни тъканни проби бяха събрани от същите области, изплакнати и поставени в RNAlater (Qiagen, Валенсия, Калифорния) и съхранявани при -20 ° C за количествена RT-PCR в реално време (qRT-PCR).

Киномасив

Протоколът от пептидни масиви се извършва, както по-рано [14] е описано и обобщено по-долу, като се използват пептидни микрочипове PepStar от JPT Peptide Technologies GmbH (Берлин, Германия). Пробите от илеум и йеюнум се претеглят и проба от 40 mg се хомогенизира чрез хомогенизатор Bead Ruptor (Omni, Kennesaw GA) в 100 μL лизисен буфер (20 mM Tris – HCl рН 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) ), 1 mM етилен гликол тетраоцетна киселина (EGTA), 1% Triton X-100, 2,5 mM натриев пирофосфат, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 μg/ml левпептин, 1 g/ml апротинин и 1 mM фенилметилсулфонил флуорид). Всички химикали са закупени от Sigma-Aldrich, Co. (Сейнт Луис, Мисури), освен ако не е посочено друго. След това решетките бяха изобразени с помощта на скенер за микрочипове Tecan PowerScanner (Tecan Systems, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) при 532–560 nm с 580 nm филтър за откриване на флуоресценция на багрилото.

Изолиране на обща РНК за qRT-PCR

Пробите от тъкани се хомогенизират с BeadBug хомогенизатор (Benchmark Scientific, Edison, NJ). Накратко, парче илеум и йеюнум (30–40 mg) бяха отстранени от RNAlater и прехвърлени в предварително напълнени микроепруветки, съдържащи циркониеви зърна (1,5 mm; TriplePure M-Bio Grade; Benchmark Scientific). Добавя се лизисен буфер (350 μL; RNeasy Mini Kit; Qiagen) и тъканите се хомогенизират за две минути при максимална скорост. Всяка тъкан се обработва поотделно. След хомогенизиране, общата РНК се изолира в съответствие с инструкциите, елуира се с 50 μL вода без RNase и се съхранява при -80 ° C.

Количествена RT-PCR в реално време

Сегментите на илеума и йеюнума от пилета, хранени с контрол и добавки, бяха подложени на qRT-PCR, за да се определи експресията на иРНК на избрани цитокини и хемокини, както е описано по-рано [22], като се използват публикувани сонди и набори праймери [22-25]. Амплификацията и детекцията бяха извършени на PCO система в реално време на StepOnePlus, използвайки Taqman RNA-to-CT 1 Step Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Стандартизацията на пробите беше направена с помощта на 28S РНК. Резултатите бяха изчислени като праг от 40 цикъла (CT) за всяка тъканна проба от пилета, хранени с контрол и добавки, и данните са представени като промяна в сгъването от контролите. Промяната в сгъването е изчислена като 2 ^ (коригирана средна стойност на храненето с добавка - коригирана средна стойност с контролно хранене) за всяка тъкан.

Данни и статистически анализ

След това масивните изображения се решетки с помощта на софтуера GenePix Pro (Molecular Devices, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) и се събира сигналът за интензивност на петна, като по този начин се гарантира, че пептидните петна са правилно свързани с техните места за фосфорилиране. Флуоресценцията с по-голям интензитет корелира с по-голямо фосфорилиране в целевото място. След това флуоресцентните интензитети за лечение бяха сравнени с контролите, използвайки програма за нормализиране на данните - платформа за интелигентен, интегриран анализ на кинома, версия 2 (PIIKA2) [26]. Полученият резултат от данните след това се използва в приложения надолу по веригата като Search Tool for Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) бази данни, използвани за определяне на промените във взаимодействията протеин-протеин и пътищата на сигнална трансдукция като описани по-рано [27].

Резултати

Генна онтология (GO) Биологични процеси (BP)

Консорциумът GO разпознава три области, свързани с генната функция и включва клетъчен компонент, молекулярна функция и биологичен процес (BP). Термините BP обикновено се фокусират върху „по-големите процеси или биологични програми“, които са резултат от множество молекулярни дейности. Използвайки функционалността STRING, бяха генерирани термини GO BP за всяка тъкан. Общият брой на BP термини, свързани с илеума и йеюнума, е съответно 309 и 355. Петнадесет от най-значимите термини за BP (въз основа на наблюдавания брой на гените) за илеума и йеюнума са показани съответно в таблици 1 и 2. Пътищата с удебелен шрифт са в топ 15 за всяка тъкан. В по-голямата си част горните 15 термина са еднакви и в двете тъкани и включват: клетъчен макромолекулен метаболитен процес, клетъчен метаболитен процес, клетъчен процес, клетъчен отговор на стимул, метаболитен процес на азотно съединение, метаболитен процес на органично вещество, първичен метаболитен процес, регулиране на клетъчния процес, реакция на стимули и трансдукция на сигнала. Честотата на фалшивите открития (FDR) за всеки термин е била силно значима и за двете тъкани (P ≤ 2 × 10 −8).

Пътища на Киото енциклопедия на гени и геноми (KEGG)

KEGG пътищата за всяка тъкан са генерирани с помощта на базата данни STRING. За тъканите на илеума и йеюнума резултатите бяха коригирани, като се използва съответната тъкан от птици на контролната диета, за да се потвърди, че промените в фосфорилирането са резултат от хранителни добавки с микрокапсулирана смес от органични киселини и растителни продукти. Общо 148 и 144 KEGG пътища се различават значително в илеума и йеюнума, съответно.

Както се вижда с термините GO BP, повечето от топ 15 на KEGG пътищата са сходни между илеума (Таблица 3) и йеюнума (Таблица 4) и също са много значими (FDR -17). Общите пътища включват: В-клетъчен рецепторен сигнален път, Хемокинов сигнален път, ErbB сигнален път, Fc epsilon RI сигнален път, Фокална адхезия, FoxO сигнален път, HIF-1 сигнален път, Инсулинов сигнален път, MAPK сигнален път, mTOR сигнален път, Сигнализиращият път на невротрофина и сигналния път PI3K-Akt са показани с удебелен шрифт. За да бъде включен, пътят трябва да бъде важен за всяка тъкан по време на двете реплицирани проучвания (n = 20 пилета/група). Пътищата, специфични за рак и вирусни инфекции, бяха изключени от анализите.

Има няколко пътища, които са напълно уникални за всяка тъкан и са показани в Таблица 5. От 148 KEGG пътища в илеалните тъкани, следните сигнални пътища са уникални и не се наблюдават в йеюнума: метаболизъм на 2-оксокарбоксилна киселина, африканска трипанозомоза, Биосинтез на бутирозин и неомицин, метаболизъм на глицеролипиди, метаболизъм на глиоксилат и дикарбоксилат, клетъчна линия на хематопоетични клетки, реабсорбция на вода, регулирана от вазопресин, и инфекция с холерни вибриони. Пътищата на KEGG, които са уникални за йеюнума, са: Ендокринна и други фактор-регулирана реабсорбция на калций, Сигнален път на таралеж, Яйчникова стероидогенеза и Ретроградна ендоканабиноидна сигнализация. Всеки от тези пътища беше значително (P Таблица 5. Уникални KEGG пътища, наблюдавани в илеума или йеюнума, но не и в двете тъкани, от пилета, хранени с добавка, в сравнение с тези на контролната диета.

Адипоцитокин и PI3K-AKT сигнални пътища

Сигналният път за адипоцитокин е един от топ 15 пътища в илеума (Таблица 3), но не е в горните 15 пътища на йеюнума (Таблица 4). Сигналният път на адипоцитокините участва в няколко други ключови пътища, включително инсулинова сигнализация, MAPK сигнализация, TNF сигнализация и NF-κB сигнални пътища, всички от които са повлияни от микрокапсулираната смес от органични киселини и растителни продукти, използвана в това проучване. Както се очакваше, по-нататъшната оценка на този път показа, че специфични протеини се различават значително в илеума и йеюнума (Таблица 6). Специфичните за илеума протеини включват: AKT3, CAMKK1, CAMKK2, CPT1A, PPARA, PPARGC1A, PRKAB1, PRKAG2, STK11 и TRAF2. Специфичните за йеюнума протеини бяха: MAPK8, PRKAA2 и PRKCQ.

Пътищата, които са били топ 15 в илеума, но не иеюнума, включват адипоцитокинов сигнален път, AMPK сигнален път и Fc гама R-медиирана фагоцитоза, всички те съдържат централната сигнална молекула AKT. В допълнение, сигналната пътека за фосфатидилинозитол 3-киназа-AKT (PI3K-AKT) беше силно значима (FDR -34) и в двете тъкани, но не всички от едни и същи протеини бяха представени в двете тъкани (Таблица 6). Специфичните за илеума значими протеини включват: AKT3, CDK6, CREB1, FLT4, HSP90B1, ITGA6, JAK1, MAP2K2, RPTOR, SOS1, STK11 и THEM4, докато специфичните за йеюнума протеини са HRAS, INSR, NGFR, PIK3AP1, PRKAA2, RAC1 и RAF1. Когато се разглеждат сигналните пътища за адипоцитокин и PI3K-AKT, AKT3 (RAC-гама серин/треонин-протеин киназа) е единственият често срещан протеин, който се наблюдава в илеума, докато не присъства в йеюнума при сравняване на птиците, хранени с добавки, с контролите. Освен това е известно, че AKT3 влияе както върху активирането на метаболизма, така и върху имунния път.

Групиране на пътища на KEGG

Взаимодействията протеин-протеин на всички статистически (P ≤ 0,05) различни протеини в илеума и йеюнума бяха подложени на алгоритъма на Марков клъстер (MCL). Използвайки инструмента за клъстериране на MCL за база данни STRING, клъстерите са генерирани и са показани за илеума и йеюнума, съответно на фигури 1 и 2. Алгоритъмът MCL е предварително настроен да генерира три различни клъстера. Въпреки че наблюдаваните пътища на KEGG са сходни между двете тъкани, получените диаграми ясно показват, че се появяват различни клъстери въз основа на типа тъкан.

Взаимодействията на илеалния протеин и протеин в илеума бяха анализирани с помощта на алгоритъма на Марков клъстер (MCL) (P ≤ 0,05) в базата данни STRING.

Взаимодействията между протеини и йеюнали в йеюнума бяха анализирани с помощта на алгоритъма на Марков клъстер (MCL) (P ≤ 0,05) в базата данни STRING.

Експресия на иРНК на цитокини и хемокини

Сигналният път на хемокините е значително различен и в двете тъкани (Таблици 3 и 4). Освен това, разликите, наблюдавани между сигналните пътища на адипоцитокин и PI3K-AKT (таблица 6), показват, че експресията на иРНК на цитокини и хемокини може да се използва за валидиране на данните от масива. Следователно, нивата на експресия на иРНК на избрани цитокини (IL1β, IL6, IL10, TNFα и IFNα) и хемокини (CXCL8 и CCL4) бяха определени в проби от илеум и йеюнум, събрани от пилета, хранени с контролни и хранителни добавки (Фигура 3). За всички измервани цитокини и хемокини нивата на експресия на иРНК в илеума от пилета, хранени с добавки, са три до седем пъти по-високи (P Фиг. 3. Експресия на иРНК на цитокини и хемокини в илеум и йеюнум от пилета, хранени с добавка, в сравнение с тези на контролна диета.

Количественият RT-PCR в реално време е използван за валидиране на данните от масива. Нивата на експресия на иРНК на различни цитокини и хемокини бяха измерени в проби Ileal (n = 10 лечение [5 на експеримент]) и йеюнални (n = 10 третиране [5 на експеримент]) от пилета от контролни и хранителни добавки. Стандартизацията на пробите беше направена с помощта на 28S РНК. Резултатите бяха изчислени като праг от 40 цикъла (CT) за всяка тъканна проба от пилета, хранени с контрол и добавки, и данните са представени като промяна в сгъването от контролите. Промяната в сгъването е изчислена като 2 ^ (коригирана средна стойност на храненето с добавка - коригирана средна стойност с контролно хранене) за всяка тъкан. Данните са представени като промяна в гънките, сравняваща пробите на тъканите, хранени с добавка, със съответната контролна проба.

Дискусия

Птичият храносмилателен тракт включва реколтата, провентрикулуса, стомаха, тънките черва и ceca с голям фокус върху реколтата и ceca; по-малко обаче се знае за правилно функциониращото тънко черво. Като цяло, храносмилането и абсорбцията на хранителни вещества се случват в тънките черва, които се състоят от три сегмента, включително дуоденалната верига, йеюнума и илеума. Както може да се очаква, въз основа на тяхната близост има някои припокриващи се функции между йеюнума и илеума. Въпреки това, всеки сегмент функционира независимо с храносмилането и усвояването на хранителните вещества, настъпващи главно в йеюнума с адсорбция на вода и минерали, основно в илеума, както и смилането и усвояването на нишесте при бързо растящите пилета [15, 30].

В допълнение към AKT3, фосфорилирането надолу по веригата на транскрипционния фактор CREB1 (CAMP реагиращ елемент, свързващ протеин 1) също е уникално за илеума (Таблица 6), което може да допринесе за повишаване на IL6 и TNFα, като и двете имат потенциал да повлияят на липидния метаболизъм и имунната функция [43]. Използваната в настоящото проучване смес от органични киселини съдържа лимонена и сорбинова киселини. Бутиратът, късоверижната мастна органична киселина и нейните производни, обикновено се използват като хранителни добавки от птицевъдната промишленост [44] и е доказано, че насърчават разпространението и узряването на чревните клетки [45], които могат да бъдат медиирани от CREB [46] . Органичните киселини съставляват най-големия компонент на сместа, използвана в настоящото проучване, и както се вижда при проучванията с бутират, възможно е лимонената и сорбиновата киселини да управляват сигнализирането чрез CREB активиране.

Доказано е, че даването на бройлери на диета, допълнена с микрокапсулирана смес от органични киселини и растителни продукти, води до отчетлив киномен профил в илеума в сравнение с йеюнума, а бъдещите проучвания допълнително ще изследват тези специфични имунни и метаболитни пътища. От чисто научна гледна точка механизмът (механизмите) за разбиране е важен, но още повече, че това разбиране ще бъде жизненоважно за движението на птицевъдството напред, за да могат те да вземат решения въз основа на здрава наука.