Резюме

при хора и други бозайници хроничната метаболитна ацидоза увеличава отделянето на калций в урината (19, 52), вторично след директното намаляване на реабсорбцията на калций в бъбреците (67), без да увеличава абсорбцията на калций в червата (43), което води до нетен отрицателен баланс на калция ( 2, 49, 51). Тъй като по-голямата част от телесния калций се намира в минералните запаси на костите (29), отрицателният калциев баланс предполага загуба на костен минерал (64). Проучванията in vivo показват, че метаболитната ацидоза, индуцирана от амониев хлорид, води до загуба на костен минерал (3) и че пациентите с проксимална бъбречна тубулна ацидоза са с по-ниска височина и имат намалена плътност на радиалните кости и по-тънки илиачни корти от незасегнатите роднини ( 50). Пациентите с дистална бъбречна тубулна ацидоза също имат намалена костна плътност и скорост на костно образуване (38); и двата параметъра се подобряват след една година лечение с HCO3 (39). По време на продължаващата метаболитна ацидоза на хронична бъбречна недостатъчност, рН на кръвта може да остане стабилно, макар и значително намалено, въпреки прогресивното задържане на водородни йони (протон), което предполага наличието на големи запаси от протонни буфери (59). Предвид голямата си маса на потенциални протонни буфери, костта е очевидно място за протонно буфериране по време на метаболитна ацидоза (12).

In vitro модел на метаболитна ацидоза, произведен чрез намаляване в средната концентрация на HCO3 ([HCO3 -]), предизвиква подчертано изтичане на калций от култивирани новородени миши калвари (11, 22, 24, 30, 36, 48), докато метаболитната алкалоза предизвиква приток на калций в костите (13). По време на краткосрочни (3 часа) култури този индуциран от киселина калциев излив се появява поради физикохимично разтваряне на костните минерали (24, 36). Въпреки това, за по-дълги периоди от време (> 24 часа), калциевият излив от костите се появява, в допълнение, поради клетъчно-медиирана костна резорбция (11, 22, 30, 48). Ние показахме, че метаболитната ацидоза води до увеличаване на активността на остеокластичната β-глюкуронидаза и намаляване на синтеза на остеобластичен колаген (11, 42, 48). В допълнение, ацидозата инхибира стимулирането на някои, но не всички, гени с незабавен ранен отговор (42) и обратимо инхибира експресията на някои гени на извънклетъчната матрица (40). Тази клетъчно-медиирана резорбция е резултат от повишен синтез на простагландин Е2, който стимулира остеокластичната резорбция и потиска остеобластната функция (31, 44, 47, 58). In vitro метаболитна ацидоза причинява отделянето на минерални калий и натрий (21, 28, 36, 37) и изчерпване на минералния карбонат (26, 27), HCO3 - и фосфат (34).

По този начин в настоящото проучване ние използвахме сканираща йонна микропроба с висока разделителна способност с вторична йонна масспектроскопия (SIMS), за да тестваме хипотезата, че хроничната ацидоза би намалила общия (напречен разрез) костен фосфат в по-голяма степен от костния карбонат чрез локализиране и сравняване промените в костния HCO3 - и фосфат след хронична инкубация на новородени миши калвари в кисела среда. Установихме, че хроничната ацидоза предизвиква спад както в напречното сечение на HCO3 - така и на фосфата без промяна в повърхностния HCO3 - и фосфата и спадът на фосфата преобладава над спада в HCO3 -. Изчерпването на тези протонни буфери, HCO3 - и фосфат, би спомогнало за смекчаване на намаляването на рН по време на хронична ацидоза.

Костна култура на органи. Неонатални (4- до 6-дневни) CD-1 мишки (Чарлз Ривър, Уилмингтън, Масачузетс) бяха убити, техните калварии бяха отстранени чрез дисекция, прилепналият хрущялен материал беше подрязан и надкостницата остана непокътната (8, 9, 11, 13, 21-28, 30-34, 36, 37, 40-42, 46-48, 60). Точно 2,8 ml от модифицираната среда на Dulbecco на Eagle (MA Bioproducts, Walkersville, MD), съдържаща инактивиран конски серум (15%), хепарин натрий (10 U/ml) и пеницилин калий (100 U/ml) бяха предварително инкубирани при Р co 2 от 40 Torr при 37 ° C за 3 часа в 35-милиметрови съдове (8, 9, 11, 13, 21-28, 30-34, 36, 37, 40-42, 46-48, 60). Установихме, че 3 h са достатъчни за уравновесяване на P co 2 между инкубатора и средата (25). След предварителна инкубация, 1 ml среда се отстранява, за да се определят първоначалните pH и P co 2 на средата и общата концентрация на калций и две калвари се поставят във всяка чиния върху решетка от неръждаема стомана. Общото съдържание на кост във всяка култура се контролира чрез използване на малки, които са на една и съща възраст и размер, чрез използване на стандартизирана процедура за дисекция и чрез поставяне на две кости във всяка чиния. Експерименталните и контролните култури се извършват успоредно и в произволен ред.

маса 1. Средни йонни концентрации и потоци

Методи за корекция, подобни на тези, които сме докладвали по-рано (15-18, 21-23, 28, 34-37, 53, 54), бяха приложени към наблюдаваните масово разрешени скорости на преброяване, за да се получат добиви на вторични йони, пропорционални на концентрацията на елементите в Образецът. Необходими са корекции поради зависимите от вида разпрашаване и йонизация на излъчените атоми. Общият брой на йони в микрофотография е функция не само на емисионните свойства на йони от проба, но и на частта от зрителното поле, заета от пробата, която в случая на калвариите може да има физически дупки. В допълнение, откритите добиви на йони зависят от степента на грапавост на повърхността на пробата. Поради тези съображения ние изразяваме нашите резултати по отношение на съотношенията на броя, получени за една и съща площ на проба. Такива съотношения са независими от частта от зрителното поле, заета от пробата, и от топографията на повърхността.

Конвенционални измервания. Средното рН и P co2 се определят с анализатор на кръвно-газови (Radiometer модел ABL 30) и калций чрез електрод (Nova Biomedical, Waltham, MA). Средата [HCO3 -] се изчислява от средната стойност на рН и Р со2, както е описано по-горе (8, 11, 25, 36). Нетният калциев поток се изчислява като Vm ([Ca] f - [Ca] i), където Vm е средният обем (1,8 ml), а [Ca] f и [Ca] i са съответно крайната и първоначалната средна концентрация на калций . Положителна стойност на потока показва движение на йона от костта в средата, а отрицателна стойност показва движение от средата в костта.

Статистика. Всички тестове за значимост бяха изчислени, като се използва дисперсионен анализ с корекция на Bonferroni за множество сравнения (BMDP, University of California, Los Angeles, CA) на цифров компютър. Всички стойности са изразени като средни стойности ± SE; P co 2 и калций. В сравнение със средата Ctl, първоначалното и крайното pH и [HCO3 -] са значително намалени в киселинната среда по време на инкубацията от 0 до 24 часа, от 24 до 48 часа и от 48 до 51 часа (Таблица 1) . Няма разлики в P co2 между Ctl и киселинна среда през който и да е период от време. В сравнение с калвариите, инкубирани в Ctl среда, по време на всяка от трите отделни инкубации и през целия изследван период от време, се наблюдава значително увеличение на нетния калциев поток от костите, инкубирани в кисела среда (фиг. 1).

ацидоза

Фиг. 1.Нетен калциев поток от новородени мишки калвари, инкубирани или в контролна (Ctl; начална среда рН ∼7,45, HCO3 - ∼26) или кисела (киселина; начална среда рН ∼7,14, HCO3 - ∼13) среда за общо 51 часа. Калвариите се прехвърлят в подобна прясна преинкубирана среда на 24 и 48 часа. Преди и след всяка инкубация средата се анализира за калций. Total представлява сумата от нетния калциев поток от трите отделни инкубации във всяка група. Положителният поток представлява движение от костта в средата. * P

HCO3 - . След 51 часа инкубация в Ctl среда, съотношението HCO3 - спрямо C2 връзката е по-голямо в напречното сечение, отколкото на повърхността на калварии, инкубирани в Ctl среда; обаче съотношението на HCO3 - спрямо CN връзката на повърхността не се различава от това, установено в напречното сечение на калварии, инкубирани в среда Ctl [Фиг. 2, Горна част, представителни спектри от повърхността на калвариите в Ctl среда (Контрол на фигура); Фиг. 3, Горна част, представителни спектри от напречно сечение на калварии в Ctl среда; Фиг. 4, Горна част, компилирани данни]. В сравнение с инкубацията в Ctl среда, инкубацията в кисела среда не променя съотношението на HCO3 - към C2 или съотношението на HCO3 - към CN на повърхността на калвариите (фиг. 2, вж. Ctl и киселина и фиг. 4, Горна част).

Фиг. 2.Масспектрите на отрицателните вторични йони на повърхността на новородени миши калвари, инкубирани в продължение на 51 часа в Ctl (Контрол на фигура) или киселинна среда. Калвариите се прехвърлят в подобна прясна преинкубирана среда на 24 и 48 часа. Брой/канал са броя/сек на откритите вторични йони некоригирани за зависими от вида вероятности за йонизация. Наблюдаваните спектри бяха измерени в 1000 канала, разпределени по равно между маса 10-90 атомни масови единици. CN, въглерод-азотна връзка; С2, въглерод-въглеродна връзка.

Фиг. 3.Мас спектри на отрицателните вторични йони върху напречно сечение на новородени миши калвари, инкубирани в продължение на 51 часа в среда Ctl или киселина. Калвариите се прехвърлят в подобна прясна преинкубирана среда на 24 и 48 часа. Брой/канал са броя/сек на откритите вторични йони некоригирани за зависими от вида вероятности за йонизация. Наблюдаваните спектри бяха измерени в 1000 канала, разпределени по равно между маса 10-90 атомни масови единици.

Фиг. 4.Съотношението на HCO3 - към C2 и съотношението на HCO3 - към CN на повърхността и в напречното сечение на новородени мишки калварии, инкубирани в продължение на 51 часа в среда Ctl или киселина (Горна част). Калвариите се прехвърлят в подобна, прясна предварително инкубирана среда на 24 и 48 часа. Отдолу: съотношение на общия фосфат (PO2 + PO3) към C2 и (PO2 + PO3) към CN на повърхността и в напречното сечение на новородени мишки калвари, инкубирани в продължение на 51 часа в среда Ctl или киселина. Калвариите се прехвърлят в подобна прясна преинкубирана среда на 24 и 48 часа. Стойностите са средни стойности ± SE. * P + P

Въпреки това, в сравнение с инкубацията в Ctl среда, инкубацията в киселинна среда доведе до намаляване на съотношението на HCO3 - към C2 и намаляване на съотношението на HCO3 - към CN в напречното сечение на калвариите (Фиг. 3, вж. Ctl и киселина и фиг. 4, Горна част). По този начин инкубацията в кисела среда предизвиква значителен спад на минерала HCO3 - в напречното сечение на калвариите, но не и на повърхността.

Фосфат. След 51 часа инкубация в Ctl среда, съотношението на общия фосфат (PO2 + PO3) по отношение на C2 и съотношението (PO2 + PO3) по отношение на CN на повърхността не се различава от това, установено в напречното сечение на калварии, инкубирани в Ctl среда (фиг. 2, Горна част, представителни спектри на повърхността на Ctl; Фиг. 3, Горна част, представителни спектри на Ctl напречно сечение; Фиг. 4, отдолу, компилирани данни). В сравнение с инкубацията в Ctl среда, инкубацията в кисела среда не променя съотношението (PO2 + PO3) към C2 или съотношението (PO2 + PO3) към CN върху повърхността на калвариите (Фиг. 2, вж. Ctl и киселина и фиг. 3, отдолу).

Въпреки това, в сравнение с инкубацията в Ctl среда, инкубацията в кисела среда доведе до намаляване на съотношението (PO2 + PO3) към C2 и намаляване на съотношението (PO2 + PO3) към CN в напречното сечение на калвариите ( Фиг. 3, вж. Ctl и киселина и Фиг. 4, отдолу). По този начин инкубацията в киселинна среда предизвиква значителен спад на минералния фосфат в напречното сечение на калвариите, но не и на повърхността.

HCO3 - по отношение на фосфата. Количеството HCO3 - спрямо (PO2 + PO3) на повърхността на калвариите не се различава съществено от това на напречното сечение на калвариите, инкубирани в Ctl среда (Фиг. 5). В сравнение с инкубацията в Ctl среда, инкубацията в кисела среда не променя съотношението на HCO3 - спрямо (PO2 + PO3) на повърхността на калвариите. Въпреки това, в сравнение с инкубацията в Ctl среда, инкубацията в кисела среда доведе до значително увеличаване на съотношението на HCO3 - (PO2 + PO3) в напречното сечение на калвариите. Тъй като инкубацията в кисела среда доведе до намаляване както на (PO2 + PO3), така и на HCO3 - в напречното сечение на калвариите (фиг. 3 и 4), увеличение на съотношението на HCO3 - към (PO2 + PO3) на кръста част от калвари трябва да показва изчерпване на (PO2 + PO3) по отношение на HCO3 -. По този начин метаболитната ацидоза предизвиква спад в минерала (PO2 + PO3) спрямо минерала HCO3 - в напречното сечение на калвариите.

Фиг. 5.Съотношение на HCO3 - към (PO2 + PO3) на повърхността и в напречното сечение на новородени мишки калвари, инкубирани в продължение на 51 часа в среда Ctl или киселина. Калвариите се прехвърлят в подобна прясна преинкубирана среда на 24 и 48 часа. Стойностите са средни стойности ± SE. * P + P

Целта на настоящото проучване беше да се провери хипотезата, че хроничната метаболитна ацидоза би намалила общия (напречен разрез) костен фосфат в по-голяма степен, отколкото костния карбонат. Използвайки сканираща йонна микропроба с висока разделителна способност с вторична йонна масспектроскопия, локализирахме и сравнихме промените в костния HCO3 - и фосфат след хронична инкубация на новородени миши калвари в кисела среда. Установихме, че в сравнение с костите, инкубирани в среда с неутрално рН, хроничната ацидоза предизвиква спад както в напречното сечение на HCO3 - така и на фосфата без промяна в повърхностния HCO3 - и фосфата и че спадът на фосфата преобладава над спада на HCO3 - . Консумацията на тези протонни буфери, HCO3 - и фосфат, би спомогнала за намаляване на спада на рН по време на хронична ацидоза.

Преди това проучихме промените в общите концентрации на среднокортикални йони след 7 дни in vivo метаболитна ацидоза, индуцирана от перорален амониев хлорид (15). Установихме, че в сравнение с мишките, пиещи само дестилирана вода, амониевият хлорид-индуцирана ацидоза води до загуба на костен натрий и калий и, както също е показано в това проучване, до изчерпване на минералните HCO3 - и фосфати. В предишното проучване ние поставихме под въпрос дали има регионални различия в отговора на минерала HCO3 - и фосфат към хронична метаболитна ацидоза. Настоящото проучване ясно демонстрира регионални различия в отговора на костите на модел на хронична ацидоза; допълнителните протони изчерпват напречното сечение, но не и повърхностния, костен фосфат и карбонат.

По-рано сме изследвали ефектите на острата ацидоза върху повърхностния и напречния разрез HCO3 - и фосфат (34). Установихме, че в сравнение с контрола, след 3-часова инкубация в кисела среда се наблюдава значително намаляване на повърхностния HCO3 - по отношение на C2 и CN без промяна в напречното сечение HCO3 -. В сравнение с контрола, след 3-часова инкубация в кисела среда, също се забелязва значително намаляване на напречното сечение на фосфата по отношение на С2, а също и на CN без промяна в повърхностния фосфат. На костната повърхност има четирикратно изчерпване на HCO3 - по отношение на фосфата и в напречно сечение седемкратно изчерпване на фосфата по отношение на HCO3 -. Тези резултати показват, че острото буфериране на Н + от костите включва преференциално разтваряне на повърхностния HCO3 - и на фосфат в напречно сечение.

Индуцираното от киселина изчерпване на фосфата ще доминира над изчерпването на HCO3 - при хронично проучване на неонатална кост на мишката не е неочаквано. Използвайки вибрационна микроспектроскопия на Раман, Tarnowski et al. (63) установи, че съотношението на карбонат към фосфат в мишите калвари 3 и 7 дни след раждането е 0,12, което показва, че има много повече фосфат от HCO3 - наличен като потенциален протонен буфер. Всеки освободен PO4 би приел протон в съотношение четири HPO4 2 - към един H2PO4 - при pH 7.4. Колкото по-ниско е рН, толкова по-голямо е съотношението на H2PO4 - спрямо HPO4 2 -. Костният CO3 2 - би се комбинирал с H +, за да образува HCO3 - и след това с допълнителен H +, за да образува H2CO3, който бързо се дисоциира до H2O и CO2.

Други изследвания показват, че по време на in vitro (7, 8, 25, 28) и in vivo (51, 59, 62) метаболитна ацидоза, минералните фази на костите изглежда буферират някои от допълнителните протони, което води до увеличаване на средата или системно рН, съответно (10, 14, 20). В култивирана кост по-рано показахме, че острото намаляване на средното рН е свързано с приток на Н + в костта (7, 8, 25), изтичане на натрий и калий от костта (22, 22, 28, 36, 37) и загуба на минерален карбонат (26, 27). Обменът на натрий и калий за Н + намалява околната концентрация на Н +. Тъй като по-голямата част от костите се състои от калциеви фосфатни комплекси, индуцираната от киселина, медиирана от клетките костна резорбция, която се появява по време на хронична метаболитна ацидоза (11, 22, 30, 48), би довела до освобождаването на минерален фосфат. Ние и други показахме загуба на костен карбонат по време на метаболитна ацидоза (4, 30) и показахме, че in vivo метаболитната ацидоза причинява намаляване на минералните HCO3 - и фосфати (15).

В настоящото проучване използвахме сканираща йонна микропроба с висока разделителна способност с вторична йонна масова спектроскопия, за да локализираме промените в костния HCO3 - и фосфат в отговор на модел на хронична метаболитна ацидоза. Установихме, че хроничната ацидоза предизвиква спад както в напречното сечение на HCO3 - така и на фосфата без промяна в повърхностния HCO3 - и фосфата и че спадът на фосфата преобладава над спада на HCO3 -. Консумацията на тези протонни буфери, HCO3 - и фосфат, би спомогнала за намаляване на спада в рН по време на хронична ацидоза за сметка на костното минерално съдържание.

Тази работа беше подкрепена отчасти от Националните здравни институти AR-46289 и DK-56788.