Силке Дице

1 Институт по фармакология и токсикология, Факултет по ветеринарна медицина, Freie Universität Берлин, Koserstr. 20, Берлин 14195, Германия; [email protected] (S.D.); [email protected] (H.F.)

Katarina R. Lees

2 Училище по ветеринарна медицина и наука, Университет в Нотингам, кампус Сатън Бонингтън, Loughborough LE12 5RD, Великобритания; moc.liamg@09seelaniratak (K.R.L.); [email protected] (J.-P.V.)

Хайдрън Финк

1 Институт по фармакология и токсикология, Факултет по ветеринарна медицина, Freie Universität Берлин, Koserstr. 20, Берлин 14195, Германия; [email protected] (S.D.); [email protected] (H.F.)

Ян Бросда

1 Институт по фармакология и токсикология, Факултет по ветеринарна медицина, Freie Universität Берлин, Koserstr. 20, Берлин 14195, Германия; [email protected] (S.D.); [email protected] (H.F.)

Йорг-Петер Войгт

2 Училище по ветеринарна медицина и наука, Университет в Нотингам, кампус Сатън Бонингтън, Loughborough LE12 5RD, Великобритания; moc.liamg@09seelaniratak (K.R.L.); [email protected] (J.-P.V.)

Резюме

Просто обобщение

Протоколите за лишаване от храна често се използват при поведенчески изследвания. Съществуват обаче ограничени доказателства кога лишаването от храна компрометира хуманното отношение към животните. По отношение на усъвършенстването на експерименти с животни, това проучване изследва ефектите от лишаването от храна върху загубата на телесно тегло и поведението при мъжки и женски плъхове. Разликата в пола в поведението и мотивационното състояние след лишаване от храна е основната констатация на изследването. Данните подчертават необходимостта от съобразени пилотни експерименти за оценка на въздействието на лишаването от храна върху животните по отношение на принципите на 3R (заместване, намаляване, усъвършенстване) в науката за животните.

Резюме

1. Въведение

Първата цел на това проучване е да се оцени максималната загуба на телесно тегло при плъхове след 16, 24 и 48 часа гладуване. В допълнение, ограниченото хранене, т.е. осигуряване или на по-малко храна, или по-кратко време, когато има храна, също е включено в тази част от проучването. Ограниченото хранене се използва най-вече в дългосрочни експериментални проучвания, например, оперантни процедури за кондициониране [22] или в проучвания за токсичност [10]. Като цяло се приема положителна корелация между продължителността на гладуването и степента на отговор [23]. Доколкото ни е известно, само няколко проучвания са изследвали ефектите на ограниченото хранене върху специфичното за вида безусловно поведение [22,24]. Heiderstadt et al., (2000) хранели плъхове на ниво, за да поддържат 20% намаление на първоначалното им телесно тегло и установили повишена активност при открито поле, заедно с повишени нива на серумен кортикостерон, измерено 37 дни след началото на експерименталния период [ 22].

Въпросът за използването на тежки лишения от храна в експериментални ситуации, по-специално кондициониране, вече беше обсъждан в миналото [25]. Moran, (1975) излага аргумента, че тежкото лишаване от храна може да промени мотивационното състояние до такава степен, че да пречи на специфичното за видовете поведение и по този начин на множество променливи по време на кондиционирането [25]. Следователно такива мотивационни промени могат да се превърнат в объркваща променлива в поведенческото тестване, например в протоколите за обучение и тестване на паметта. Това важи по-специално за експериментални ситуации, когато субектите са лишени от храна и хранителните продукти се използват като награда.

Следователно, втората цел на настоящото проучване е да се изследват ефектите от хранителната мотивация в конфликтна ситуация, която не включва кондициониране и по този начин намалява броя на променливите. За тази цел използвахме експериментален набор, базиран на конфликта между неофобия/тревожност и глад [26]. Нашата цел беше да изследваме връзката между продължителността на гладуването и мотивацията на животното да преодолее потенциално неприятна ситуация в полза на получаването на храна. За балансиране на тревожността на плъховете спрямо мотивацията на глада е използван тест с модифицирано отворено поле (mOF) [27], известен също като тест за индуцирана от новост хипофагия (NIH) [28,29]. MOF е широко валидиран в нашата лаборатория и представлява модел на конфликт, който е валидна мярка за поведение, свързано с тревожност, тъй като анксиолитичните лекарства стимулират приема на храна в такава неприятна ситуация [27].

За да изследваме възможните дълготрайни ефекти върху емоционалните състояния на животните, ние изложихме плъховете на теста с повишен плюс лабиринт (EPM) за поведение, свързано с тревожност. EPM тестът е фин и често използван тест за оценка на свързаното с тревожност и изследователско поведение при гризачи [30]. Тестът е широко валидиран и оценен [31,32,33,34]. Доказано е, че предшестващият стрес оказва значително влияние върху измерванията, свързани с тревожност, поведение в този тест [35,36,37], което го прави стабилен животински модел на състояние на тревожност [36,38].

Предполагаме, че лишаването от храна ще доведе до значително намаляване на телесното тегло, придружено от намалено поведение, свързано с тревожността, в mOF теста, т.е.повишена мотивация за хранене в отвратителна среда. Размерът на поведенческите ефекти трябва да корелира с продължителността на лишаването от храна.

Резултатите от настоящото проучване могат да помогнат за придобиване на нови идеи за усъвършенстване на различни протоколи за хранене на лабораторни животни, което следователно ще намали стреса при животните и ще подобри тяхното благосъстояние по време на настаняването и в експерименталните условия.

2. Експериментална секция

2.1. Животни

Експериментите са извършени в съответствие с насоките на германския Закон за защита на животните и са одобрени от Берлинския държавен орган („Landesamt für Gesundheit und Soziales“ (LaGeSo); G 0153/12). Етичната приемливост на експериментите с животни е решаваща част от заявлението, което беше обсъдено със служителя за хуманно отношение към животните от Freie Universität Berlin и впоследствие прегледано от етична комисия, подпомагаща LaGeSo Berlin. Потенциалът за прилагане на концепцията за 3R беше стриктно проучен по време на всяка част от настоящото проучване. Всички участващи експериментатори бяха добре обучени и опитни в използването на лабораторни животни и тяхното поведение.

Използвани са общо 51 наивни мъжки (n = 25; Ø 440 g ± 30 g) и женски (n = 26; Ø 260 g ± 16 g) плъхове Wistar (Harlan Laboratories, Horst, Холандия) на възраст 5–6 месеца. . Преди експериментите животните са били настанявани в групи (n = 2–4) в клетки от тип IV Macrolon (59 × 38 × 20 cm, площ на пода 1,815 cm 2; Ehret, Wandlitz, Германия) с прах от твърда дървесина без прах ( Хигиенни постелки за животни, J. Rettenmaier & Söhne GmbH und Co. KG, Rosenberg, Германия) при стандартни условия (стайна температура 22 ± 2 ° C; относителна влажност 55% ± 10%) при график от 12 часа светлина/тъмно (светлините светят в 6:00 сутринта). Домашните клетки са обогатени от хартиени тъкани и метални тръби като скривалища. Преди и по време на експериментите плъховете получават стандартната лаборатория, с която са свикнали (V153x R/MH: 19% протеин, 3,3% мазнини, 4,9% фибри, 6,4% пепел, микроелементи и витамини; ssniff, Soest, Германия) и чешмяна вода и се обработваха и претегляха през ден. Веднъж седмично домашните клетки бяха почиствани и оборудвани с нови легла от професионален животновъд. Животните са били свободни от патогени съгласно препоръките на Федерацията за лабораторни животински изследвания (FELASA) и тяхното здравословно състояние се наблюдава на тримесечие.

2.2. Експериментален дизайн

2.2.1. Лишаване от храна и график за хранене с фиксирано време

След първоначално измерване на телесното тегло, което ни позволи да изключим всякакви значителни отклонения, животните бяха разпределени на случаен принцип в петте независими експериментални групи от 16 h, 24 h, 48 h лишаване от храна (без достъп до храна), 4 дни храна ограничение (хранене с фиксирано време; FF) или хранене ad libitum (контролна група). Шестнадесет часа преди започване на експериментите, плъховете бяха преместени в единични корпуси (клетки Macrolon тип III; период на привикване), обогатени с метални тръби като скривалища. В групата за хранене с фиксирано време животните са получавали храна в продължение на 4 часа дневно (8: 00–12: 00 сутринта) в продължение на четири последователни дни [27]. Контролната група, захранена с ad libitum, е била подложена на същите процедури за работа (напр. Единичен корпус, измерване на телесно тегло). Водата е била свободно достъпна по всяко време. С изключение на контролната група (пет мъже, шест жени), всяка група се състои от пет мъже и пет жени. Размерите на групите бяха изчислени чрез G * Power 3 (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Düsseldorf, Germany) [39].

2.2.2. Мерки за телесно тегло

Телесното тегло по отношение на тестването на mOF се измерва непосредствено преди започване на лишаването от храна и след 5-минутно излагане на теста, т.е. преди повторно хранене. Телесното тегло преди гладуване или хранене с фиксирано време беше определено на 100% за всяко животно и телесното им тегло по време на mOF беше сравнено с това.

2.2.3. Поведенчески експерименти

Всички експерименти са проведени в шумозаглушена стая между 8: 30–12: 30 сутринта. Животните бяха привикнати в стаята в продължение на 1 час преди започване на съответния експеримент. Поведението на всеки плъх беше записано и анализирано с помощта на компютърно базирана система за проследяване (VideoMot 2; TSE-Systems, Bad Homburg, Германия). Тестовите арени бяха почистени с Meliseptol ® между всяко животно. Времето на периодите на лишаване от храна беше разпределено, за да се гарантира, че животните от отделните експериментални групи са гладували по едно и също време в началото на поведенческото тестване, което се извършва през последния час на лишаване от храна.

2.2.4. Модифициран тест на открито поле (mOF)

Тестът на mOF се извършва, както е описано от Rex et al., (1998) [8]. Накратко, плъховете бяха поставени индивидуално в единия ъгъл на ярко осветено (350 лукса) бяло открито поле (100 × 100 × 40 см), обърнато към центъра на откритото поле, в което бяха на разположение познати хранителни гранули (стандартен чау). Плъховете бяха наблюдавани в продължение на 5 минути и тяхното поведение беше анализирано за следните параметри: честота на приема на храна (% от хранещите се плъхове на група), латентност към първоначалния контакт (и) с храна, изминато разстояние (cm, хоризонтално движение) и брой на задните колела (вертикална активност). В края на всеки експеримент животните се връщаха в домашните им клетки и се хранят ad libitum.

2.2.5. Тест за повишен плюс лабиринт (EPM)

Двадесет и четири часа след завършване на експеримента mOF и повторно хранене, животните бяха тествани за поведение, свързано с тревожност, с помощта на EPM. Лабиринтът се състоеше от две отворени рамена (50 × 15 см) и две затворени рамена (50 × 15 × 10 см), които бяха свързани с централна платформа (15 × 15 см; височина на лабиринта: 64 см). Осветеността беше 250 lux на повърхността на отворените рамена, 60 lux в затворените рамена и 200 lux на централната платформа. Плъховете бяха поставени на централната платформа, обърната към ъгъла между отворено и затворено рамо, което позволяваше еднаква възможност за влизане в едно от тези рамена. Всяко животно се наблюдава в продължение на 5 минути. Като класически параметри, свързани с поведението на тревожност, се записва броят на влизанията в отворените ръце във връзка с общия брой влизания и времето, прекарано в отворените ръце. В допълнение бяха измерени общото изминато разстояние (cm) и броят на задните колела (тези параметри не са независими от безпокойството в EPM). Броят на спада на главата се наблюдава като параметър за оценка на риска.

2.2.6. Представяне и анализ на данни

храна

Ефект на лишаване от храна (16 h, 24 h, 48 h), график на хранене с фиксирано време (FF; 4 h в продължение на 4 дни) или свободно хранене (контрол) върху спонтанната активност в модифицирания тест на открито при мъжки и женски плъхове . Данните са средни + S.E.M. Двупосочната ANOVA показа секс значение, *** p Фигура 4). Въпреки това, значителен основен ефект от секса върху свързаните с тревожност параметри и времето, прекарано в отворени обятия (записи (%): F1,41 = 7,32, p = 0,01; време (а): F1,41 = 10,23, p = 0,003 ) е намерено. Жените показват увеличение на тези параметри, т.е.посещават по-често отвратителните рамена, което предполага анксиолитично поведение (Фигура 4а, б). Въпреки че не е имало цялостен ефект на храненето върху поведението на ЕРМ, женските плъхове, които преди са били изложени на хранене с фиксирано време, показват тенденция към значимост за прекарване на по-малко време на отвратителните отворени ръце (p = 0,083) (Фигура 4 b).

4. Дискусия

В това проучване при плъхове са оценени промени в телесното тегло в резултат на лишаване от храна и ограничаване на храната и последващи промени в поведението. Понастоящем има ограничен брой проучвания, които анализират заедно тези параметри и следователно настоящото проучване има за цел да осигури по-изчерпателен поглед върху ефектите от лишаването от храна и ограничаването на храните при плъховете. Основната констатация е, че лишаването от храна и храненето на фиксирано време причиняват значителна и независима от пола загуба на телесно тегло, но само 48 часа лишаване от храна има измерим ефект по време на поведенчески тестове. Това откритие не се очакваше, тъй като периодите на лишаване в диапазона от 16 часа и 48 часа се използват широко в поведенчески проучвания [13].

Средната загуба на тегло от 8% (наблюдаваният максимум е 13% при един плъх) след периода на лишаване от 48 часа, както е съобщено тук, е в съответствие с предишните доклади [40,41,42]. Други обаче съобщават за по-висока средна загуба на тегло от 15% при плъхове Wistar след само 24 часа лишаване [43]. При други щамове на плъхове се съобщава дори за по-високи намаления до 18% след 24 часа бързо [44,45,46,47]. По този начин, щамът и подгрупите, които могат да съществуват в различни лаборатории, могат да бъдат променлива, която допринася за степента на загуба на телесно тегло след лишаване от храна. По отношение на умерената загуба на тегло, наблюдавана в настоящото проучване, компенсаторната консумация на вода може да бъде изключена, тъй като различни изследвания показват, че намаляването на телесното тегло по време на периоди на лишаване от 3 и 4 дни е успоредно с намален прием на вода [41,48]. Друга променлива може да бъде възрастта на животното, като по-младите плъхове губят по-висок процент телесно тегло от по-старите плъхове. Доказателствата за това идват от проучване на Li и Wassner [49], където по-младите плъхове са загубили 29% телесно тегло след 24 часа лишаване от храна.

Ето защо предлагаме да се извършат пилотни проучвания, за да се гарантира, че загубата на тегло не надвишава разрешената граница за отслабване, наложена от регулаторния орган и/или комисията по етика на животните, за да се предотврати неоправдано страдание на животните.

Настоящото проучване предполага, че въпреки значителната загуба на телесно тегло, мотивацията за хранене при анксиогенни условия изисква определено ниво на загуба на телесно тегло. Дискусия на нашите открития в контекста на предишни проучвания, както от нашата лаборатория, така и от други групи, разкри, че това ниво изглежда зависи от различни фактори. Следователно се препоръчват персонализирани пилотни проучвания, които оценяват кое ниво на загуба на телесно тегло действително влияе върху мотивационното състояние в дадена експериментална ситуация. Това също може да сведе до минимум вредните интерференции, дължащи се на „прекомерно лишаване“ от мотивационни състояния, например по време на експерименти за кондициониране. Резултатът от тези пилотни проучвания всъщност може да подобри благосъстоянието на плъховете чрез избягване на ненужно дълги периоди на гладно.

Третата част от нашето проучване имаше за цел да отговори на въпроса дали при регенерираните плъхове опитът от предходен период на лишаване или ограничаване на храната може да доведе до трайни поведенчески последици. Физиологичните промени настъпват по време и след периода на лишаване от храна, особено по време на периода на хранене [41]. Освен това лишаването от храна е потенциално стресово събитие. По този начин се съобщава, че острото лишаване за 24 часа, но не и за 6 и 16 часа, предизвиква повишаване на плазмените нива на кортикостерон при плъхове Sprague Dawley [62]. Не само острото лишаване от храна, но и хроничното ограничение оказват влияние върху няколко нива на плазмен хормон, с повишаване на кортикостерона при плъхове Wistar и при други щамове плъхове [19,63], въпреки че контрастните открития показват, че значително увеличение на кортикостерона при плъхове Wistar има не се появяват преди поне 5 дни лишаване от храна [64,65].

В нашето проучване само женската група, хранена на фиксирано време, показва евентуално трайни поведенчески ефекти след повторно хранене, изразено чрез тенденция на поведение, свързано с тревожност в EPM. Подобен ефект, ако е истина, би противоречил на предишни констатации, когато излагането на женски плъхове Sprague-Dawley на цикли на ограничаване на калориите, последвано от повторно хранене, не е повлияло поведението, свързано с безпокойството [66]. Настоящото проучване обаче не може да изключи някакви дълготрайни поведенчески ефекти, по-специално при поведения, които не са пряко свързани с безпокойството, тъй като те не са изследвани тук.

Наблюдаваното цялостно анксиолитично поведение при жени при ЕРМ е в съответствие с предишни проучвания [67,68,69]. Въпреки сексуалния ефект върху двигателната активност, който вероятно не е независим от анксиолизата поне в EPM [32], лишаването от храна и ограниченията сами по себе си не оказват влияние върху двигателната активност в съответните тестови групи. Това съвпада с по-ранни открития [70], демонстриращи при плъхове Шерман, че двигателната активност не е била засегната от лишаване от храна, докато други форми на експлораторно поведение са се увеличили. По същия начин при плъховете Long-Evans, лишаването от храна не повлиява локомоторната активност [71].

При по-нататъшни проучвания по темата трябва да се извърши систематична промяна на експериментални променливи, например различна степен на лишаване спрямо различна степен на отвращение. Съпътстващите мерки на хормоните на стреса, но също така и анализът на поведението на домашните клетки могат да помогнат за по-нататъшно обосноваване на ефекта от различни графици на хранене и лишения върху благосъстоянието.

5. Заключения

В заключение, нашите резултати биха могли да помогнат за подобряване на хуманното отношение към животните чрез усъвършенстване на учебните планове, които включват ограничаване на храната или лишаване от експериментални животни. Данните показват, че загубата на тегло и мотивацията за хранене не са силно свързани. Нашите резултати са в полза на пилотни проучвания за осигуряване на добро благосъстояние по време на действителните поведенчески експерименти.

Благодарности

Авторите благодарят на Sabine Jacobs за отличната техническа помощ и на Wiebke Gentner за доказателство при четенето на ръкописа.