Резюме

Флуоропробата на основата на нитробензоксадиазол (NBD-Bu) е предназначена да изследва клетъчната метаболитна активност в рака и нормалните клетки. NBD-Bu показва значително подобрение на флуоресценцията при селективно свързване със серумен албумин. Специфичността на мястото на NBD-Bu е изследвана чрез анализ на конкурентно изместване в присъствието на специфични за мястото маркери като варфарин и ибупрофен. Впоследствие резултатите от флуоресцентната микроскопия с висока резолюция консолидират потенциала на NBD-Bu за клетъчно изобразяване и откриване на анормална клетъчна метаболитна активност.

маркер

Въведение

Серумният албумин (SA) е най-разпространеният водоразтворим протеин, открит в кръвната плазма, заемащ почти 60% от общите протеини в кръвната плазма. 1–2 Човешкият серумен албумин (HSA) има 585 аминокиселинни остатъка в единична полипептидна верига, докато говеждият серумен албумин (BSA), който е 76% хомологичен на HSA, има 583 аминокиселинни остатъка. 1 Той функционира като гъвкав транспортен протеин, транспортирайки малки лекарствени молекули, жлъчна сол, хормони, витамини, метали и играе важна роля, като допринася с 80% за поддържане на онкотичното налягане между кръвоносните съдове и тъканите. 3-4 Освен това албумините са отговорни главно за поддържането на рН на кръвта. 5–6 SA също се използва като добавка в клетъчната култура, тъй като подобрява растежа и жизнеспособността на клетките. 7 Високото ниво на SA се предизвиква от тежка дехидратация и високо протеинова диета, докато дефицитът на същия причинява дисфункция на кръвоносната система, което навежда откриването на SA да бъде изключително важно. 6

Тук разработихме включена електронеутрална солватофлуорохромна сонда с отлична селективност, специфичност и чувствителност към полярността на микросредата и моментна ефективност на свързване към BSA. Селективността на NBD-Bu за BSA беше оценена с помощта на няколко важни протеина с различни структури и функции. Освен това, ние сме използвали два маркера на сайта, а именно. варфарин и ибупрофен за изследване на свързващите явления с нашата сонда. Сред няколкото хидрофобни свързващи кухини вътре в BSA, варфаринът се свързва с място I, докато ибупрофенът се свързва с място II. 23 NBD-Bu показва забележима синя промяна в максимумите на емисии при свързване към BSA и се установява, че константата на свързване е по-висока от тази на ибупрофен. Сондата също оцелява в теста за селективност дори в присъствието на други биологично значими протеини. Освен това успяхме да проучим разликата в метаболитната активност на раковите клетки в сравнение с нормалните клетки, използвайки образи на живи клетки.

Резултат и дискусии

NBD частта е свързана с лесната синтетична процедура и е добре известна със своята чувствителност към полярността на околната среда, като по този начин е потенциален сензор за мицеларна, както и за протеинова микросреда. Въз основа на предишни доклади, в NBD частта е включена къса бутилова верига, за да се придаде по-добро флуоресцентно свойство и подходяща липофилност за подобрен афинитет на свързване с хидрофобния джоб на протеина. 24 След синтеза на NBD-Bu, той се характеризира с ЯМР спектроскопия (фиг. S1-2) и масспектрометрия (фиг. S3). Оптичната чистота се потвърждава и чрез сравняване на спектрите на абсорбция и възбуждане (фиг. S4). NBD-Bu съдържа богат на електрон азотен атом, привързан към бутилова верига и NO2 група с електронен дефицит. Тези две части са свързани чрез ароматен пръстен, което го превръща в класическо ИКТ багрило. Като цяло, ИКТ багрилата добре реагират на полярността на разтворителя, като по този начин показват фотофизично поведение, зависещо от полярността. 25

За да потвърдим ИКТ свойствата на NBD-Bu (Схема 1), извършихме задълбочено спектроскопско изследване, използвайки различни разтворители с различна полярност. Както в основно, така и в възбудено състояние, спектрите се изместват към по-голяма дължина на вълната заедно със спектралното разширяване при увеличаване на полярността на разтворителя (Фиг. 1а-b, Таблица S1). Впоследствие беше установено, че флуоресцентният живот на NBD-Bu (фиг. 1в) е по-дълъг в неполярните разтворители в сравнение с полярните, което се дължи главно на наличието на взаимодействие на водородно свързване между молекулите на багрилото и разтворителя, произхождащи от по-високи не -радиационни скорости на разпадане в полярни разтворители. Максималните емисии и продължителността на флуоресценцията варират линейно (фиг. 1г, S5), като полярността затвърждава факта, че NBD-Bu може да се използва за локално засичане на околната среда. Такава характеристика го прави отличен кандидат да усети локалната микрополярност вътре в хидрофобните джобове на протеинови молекули.

(а) Синтетична схема на флуорозонда N-бутил-7-нитробензо [с] [1,2,5] оксадиазол-4-амин (NBD-Bu), (б) гранична молекулярна орбитална картина на NBD част преди и преди след заместване