РЕЗЮМЕ

Социалните взаимодействия са от решаващо значение за размножаването и оцеляването на много организми, включително тези, които използват визуални, слухови и обонятелни сигнали, за да сигнализират за наличието на опасност. Drosophila melanogaster излъчва обонятелен алармен сигнал, наречен Drosophila стрес одорант (dSO) в отговор на механично раздвижване или токов удар, а специалистите избягват области, заети преди от стресирани индивиди. Контекстната, генетична и невронна основа на емисията и реакцията на dSO обаче не са получили малко внимание. Използвайки тест за двоичен избор, ние установихме, че нито възрастта и полът на излъчвателите, нито времето на деня влияят върху емисията или избягването на dSO. Въпреки това, както полът, така и състоянието на чифтосване са повлияли на отговора на dSO. Също така демонстрирахме, че dSO не е специфичен за видовете, така че не трябва да се счита за феромон, а като общ алармен сигнал за дрозофила. Въпреки това, нивата на реакция както към вътрешните, така и към специфичните сигнали се различават между видовете и се обсъждат възможните причини за тези разлики.

drosophila

АКЦЕНТИ

Емисията на dSO, силно летлива химическа смес, излъчвана от стресирани мухи, не е специфична за контекста

Отговорът на dSO е специфичен за контекста, повлиян от фактори като възраст и състояние на чифтосване.

Тъй като мухите реагират на летливи вещества за стресирани хетероспецифики, dSO не трябва да се счита за алармен феромон, а като алармен сигнал.

ВЪВЕДЕНИЕ

Социалните взаимодействия, използващи зрителни, слухови, обонятелни и/или тактилни сигнали, са от решаващо значение за успешното развитие, оцеляване и размножаване на организмите (Dahanukar & Ray, 2011; Sokolowski, 2010), включително тези, свързани с опасността. Реакцията на опасностите може да предизвика редица различни поведенчески реакции (Yew & Chung, 2015), включващи различни сензорни модалности, които зависят от вида и екологичния контекст (Verheggen, Haubruge, & Mescher, 2010). Обонятелните алармени сигнали обикновено се състоят от силно летливи, непостоянни молекули (единични съединения или като смес), които бързо информират специалистите за потенциална опасност, без да генерират постоянно състояние на тревога (Verheggen et al., 2010). Алармени феромони, които по дефиниция модулират взаимодействията между особеностите, са докладвани при широк кръг животни, от нематоди до хора (Chao, Fleischer, & Yang, 2018; Hunt, 2007; Mathuru et al., 2012; Mujica-Parodi et al., 2009; Vandermoten, Mescher, Francis, Haubruge, & Verheggen, 2012; Zhou et al., 2017), въпреки че в някои случаи тези обонятелни сигнали предизвикват отговори при тясно свързани симпатрични видове, споделящи общи естествени врагове (Napper & Pickett, 2008 ).

При стресираните индивиди от Drosophila melanogaster излъчват обонятелна сигнализация, Drosophila стрес-одорантът (dSO) и мухите избягват области, заети преди това от стресирани специалисти (Suh et al., 2004). Въглеродният диоксид (CO2) е един компонент на dSO и е изследван сензорният път за възприемане на CO2 (Bracker et al., 2013; Faucher, Forstreuter, Hilker, & de Bruyne, 2006; Krause Pham & Ray, 2015; Kwon, Dahanukar, Weiss и Carlson, 2007; Siju, Bracker, & Grunwald Kadow, 2014; Suh et al., 2007; Suh et al., 2004; Turner & Ray, 2009). Отговорът за избягване обаче е по-слаб само за CO2, отколкото за dSO, което предполага, че присъстват други компоненти (Suh et al., 2004). Знаем, че двата пола реагират на dSO, въпреки че нивата на реакция варират в зависимост от генетичния фон (Fernandez et al., 2014) и възрастта (Brenman-Suttner et al., 2018), както и плътността на излъчвателите (Fernandez et al., 2014). За да се улесни идентифицирането на пълната смес от dSO, както и на включените гени и сензорни пътища, е от съществено значение да се знаят условията, които водят до високо производство на обонятелната реплика. Затова проведохме експерименти, изследващи ефекта на различни фактори върху емисията и възприемането на dSO.

МЕТОДИ

Експериментални животни

Всички възрастни D. melanogaster (Canton-S) и D. simulans и D. suzukii възрастни, използвани в различните анализи, са получени от лабораторни колонии, поддържани в Западен университет. D. melanogaster и D. simulans се отглеждат на диета Drosophila Jazz-Mix ™ (Fisher Scientific, ON, Канада) при 25 ° C, 50% относителна влажност при 12L: 12D светлинен цикъл. D. suzukii се поддържа на среда от банан-царевично брашно-агар (Jakobs, Ahmadi, Houben, Gariepy и Sinclair, 2017) при 21 ° C, 65% относителна влажност при 14L: 10hD светлинен цикъл. Девите са получени чрез пол на мухи при поява и задържане на възрастни в еднополови контейнери (приблизително 40 мухи/контейнер), докато е необходимо. За да се получат съчетани мухи, новоизникналите мухи (20 мъжки и 20 женски) бяха държани заедно, докато не бъдат тествани.

dSO анализи за избягване

Освен ако не е посочено друго, всички експерименти са използвали съчетани възрастни на възраст между 3-7 дни и са били проведени при 25 ° C и 50% относителна влажност между 12:00 и 16:00, за да се намалят вариациите, свързани с периодичността на диел в поведението (Dubruille & Emery, 2008). Подробно описание на анализа за избягване на dSO може да се намери в (Fernandez et al., 2014). Накратко, реагиращите мухи се поставят в бинарен Т-лабиринт при условия на равномерна светлина, където те имат избор между контролен флакон и един, съдържащ dSO, произведен от стресирани мухи, които са били завихрени за 1 минута (15 секунди, 5 секунди в покой, повторени 3 пъти) или флакон, зает преди от нестресирани мухи. След 1 минута регистрирахме положението на всички мухи и след това изчислихме индекса на ефективност (PI), като извадихме броя мухи-респонденти в експерименталния флакон от броя мухи във въздушния флакон, разделен на общия брой мухи, използвани в анализ и се умножава по 100. Това осигурява мярка за предпочитанието, където положителна стойност показва, че отговорилите са избягвали експерименталния флакон, докато отрицателна стойност показва, че са привлечени от него. По този начин, пълното избягване на експерименталния флакон би довело до PI от 100, докато ако мухите са разделени по равно между контролните и експерименталните флакони (без предпочитание), PI ще бъде 0.

Когато се изискват сигнали от необезпокоявани мухи, ние използвахме апарата за противотока, за който първо съобщава Benzer (1967), както е описано в Fernandez et al. (2014). Мухите бяха изтеглени от засенчен флакон с държач в осветен чист флакон с помощта на 15W бяла светлина, където останаха за 1 минута, преди да бъдат отстранени по същата техника.

Предишни експерименти (Fernandez et al., 2014) установиха, че 3-7-дневните сдвоени мухи избягват dSO, произвеждан или от секс, или от смесена полова популация. Не беше известно обаче дали състоянието на чифтосване е повлияло отговорите, така че сравнихме отговорите на чифтосани и девствени мухи, използвайки 30 съчетани или девствени отговори (всички мъже, всички жени или 15 мъже и 15 жени) с източник на dSO, произведен от 70 излъчватели (единични или смесени полове). Това бяха същите плътности, тествани в резултатите от предишни проучвания, но тъй като индексът намалява с броя на излъчвателите (Fernandez et al., 2014), повторихме експеримента, използвайки 20 излъчватели и 15 реагиращи.

За да тестваме ефекта на възрастта върху емисиите на dSO, направихме 9 повторения, където 30 мухи (смесен пол) бяха изложени на сигналите от 70 възрастни, на възраст от 2-5 дни до 7 седмици. Също така тествахме пола на излъчвателите, като изложихме 15 смесени сексуални отговори на dSO, получени от 20 мъже, 20 жени или комбинация от двете, с минимум 9 повторения за всяка комбинация. Изследвахме влиянието на възрастта на респондентите, като изложихме 15 респонденти на dSO, получен от 20 мъже или жени, които са били на възраст 3-4 или 7-10 дни. Имаше 9 повторения на лечение.

За да определим дали може да има периодичност на диела или в емисията на dSO, или в отговор на нея, ние поддържахме две колонии под 12L: 12D фотопериодичен режим, но с включен сигнал в 04:00 в един и в 08:00 в други. Това ни позволи да тестваме различни комбинации както за излъчватели, така и за реагиращи, както е показано в Фигура 1, където ZT се отнася до времето на включените светлини. Имаше 9 повторения за всички комбинации, като половете се тестваха отделно.

Експерименталният дизайн, използван за определяне на потенциалния ефект на времето през деня както върху излъчването, така и върху приемането на dSO от D. melanogaster.

Докато Fernandez et al. (2014) показа, че само 10 мухи могат да се използват като източник на dSO, не е известно дали по-ниските плътности произвеждат достатъчно, за да предизвикат отговор. Следователно, ние изследвахме поведението на 30 отговорили, когато бяха тествани с летливи сигнали, произведени от 1 (мъже или жени - данните се събират като не са статистически различни, данните не са показани), 2, 5 или 10 мухи от лица със смесен пол с поне 11 повторения за всяка емитерна възраст.

Тествахме важността на интензивността на стреса, сравнявайки отговора на 15 отговори на смесени пола на dSO от 20 излъчватели, които са били подложени на 1, 2 или 3 пристъпа (15 секунди) на завихряне, за 1 минута или които са били прехвърлени във флакона чрез разклащане. Също така сравнихме отговора на мъже и жени на миризмата от 20 мухи (10 мъже/10 жени), които не са били подложени на стрес (пренесени с помощта на реакцията на светлина, както е описано по-горе), завихрени за 1 минута или държани във флакон без агитация или храна за 12ч. Във всички случаи имаше поне 9 повторения на лечение.

За да тестваме разсейването на dSO, сравнихме отговора както на мъжете, така и на жените към източници, непосредствено следващи, или 1 или 2 минути след излъчването е завихрено и отстранено. Също така изследвахме времето след завихрянето, че е излъчен dSO. В този случай мухите бяха завихрени, оставени да си починат 10 секунди, 1 мин, 1 или 2 часа, преди да бъдат прехвърлени в чист флакон за 1 минута. Мухите бяха въведени и отстранени от тестовия флакон чрез светлинната реакция, за да се гарантира, че няма допълнително разбъркване. Във всички анализи имаше 9 повторения.

Тъй като има доказателства, че dSO, излъчен от D. melanogaster, съдържа компоненти, различни от CO2, (Suh et al., 2004), проведохме анализи, сравняващи вътрешните и междувидовите отговори на D. melanogaster, D. simulans и D. suzukii, с минимум 9 повторения за всяка комбинация.

Статистически анализ

Използвани са еднопосочни и двупосочни ANOVA, последвани от post hoc тест на Tukey за коригиране на множество сравнения в GraphPad Prism (версия 7.0a за Mac, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com). Във всички анализи с въздушни флакони като контрола, ние използвахме t-тестовете на Welch, за да потвърдим, че реакцията на въздуха не се различава значително от 0 и тъй като това винаги беше така, стойностите не бяха включени. Използва се и t-тест на Welch за сравняване на ефекта на възрастните мъже върху отговора на dSO.

РЕЗУЛТАТИ

Отговорът не е бил засегнат нито от пола (F1,32 = 0,9248, P = 0,3434), нито от състоянието на чифтосване F1,32 = 4,098, P = 0,0514), когато 30 отговорили са били тествани на dSO от 70 излъчватели (Фигура 2А, Б).

Ефектът на пола (A и C) и състоянието на чифтосване (B и D) върху отговора на възрастните D. melanogaster на dSO при две различни плътности на излъчващите и реагиращите.

Обаче отговорът на 15 отговорили на dSO от 20 излъчватели и за двата пола (F1,29 = 7.191, P = 0.0120) и състоянието на чифтосване (F1,29 = 8.088, P = 0.0081) бяха значителни. Жените показаха по-голяма реакция от мъжете (това също беше незначителен случай при по-висока плътност) и при двата пола чифтосаните индивиди бяха по-отзивчиви от девиците (Фигура 2C, D).

Ефектът на възрастта (A) и пола (B) на излъчвателите, както и възрастта на отговарящите (C) върху отговора на възрастните D. melanogaster на dSO.

Ефектът от времето по време на фотофазата, при която излъчвателите и реагиращите се тестват върху отговора на възрастните D. melanogaster към dSO.

Ефектът на плътността и формата на излъчватели на стрес бяха предмет на отговора на възрастните D. melanogaster към dSO.

Ефектът на времето върху устойчивостта на dSO (A) и времето след излъчването се възбуди върху отговора на възрастните D. melanogaster на dSO.

Топлинна карта, сравняваща отговора на възрастните D. melanogaster, D. simulans и D.susukii на dSO, излъчен от специфични и хетероспецифични възрастни. Анализът сравнява всички стойности с отговора на D. melanogaster към специфични вещества.

ДИСКУСИЯ

Нашите резултати подкрепят идеята, че възрастните D. melanogaster излъчват обонятелни сигнали, които могат да повлияят на поведението на специалистите, когато са подложени на някаква форма на стрес. Отчасти това вероятно е резултат от физиологични промени, както се наблюдава при пчелите, които са били завихрени (Bateson, Desire, Gartside и Wright, 2011), което увеличава производството на CO2, който е основен компонент на dSO (Suh et al., 2004).

Отговорът на алармените сигнали обаче е контекстуален, вероятно поради компромиси между свързаните разходи и ползи, свързани с репродуктивния успех, както е ясно показано в отговорите на различни етапи на зелената прасковена листна въшка към (E) -β-фарнезен ( Montgomery & Nault, 1978). Такъв е случаят и с D. melanogaster, реагиращ на dSO. Например, по-ниските реакции на девствените мухи в сравнение с двойки могат да се отнасят до възможности за чифтосване, като се има предвид, че очакваното средно дълголетие на възрастните дрозофили при полеви условия е около 3-7 дни (Rosewell & Shorrocks, 1987). По този начин, докато девствените и сдвоените лица, които напускат даден обект, биха се възползвали от избягването на потенциална опасност, девиците, напускащи обект, където има специалисти, намаляват шансовете си за придобиване на партньор.

Данните от няколко от нашите експерименти показват, че сдвоените мъже показват по-ниски нива на отговор, отколкото сдвоените жени на същата възраст, което отново може да бъде свързано с аспекти на репродуктивния успех. Колкото повече партньори мъжът придобива, толкова по-висок е потенциалният му репродуктивен ефект през целия живот (например Royer & McNeil, 1993), като по този начин по-ниската реакция на dSO може да увеличи шансовете му да срещне възприемчива жена. По същия начин, намирайки се на опасно място, може да намали краткосрочните възможности за яйцеклетка за сдвоена женска, като се има предвид, че едно чифтосване й осигурява достатъчно сперматозоиди, за да оплоди пълния си яйцеклетен комплимент, оставянето ще увеличи шансовете й за оцеляване и увеличаване на възможностите за бъдещо яйценосене. По същия начин отсъствието на възрастов отговор на dSO при жените не е изненадващо, въпреки че най-високата дневна продукция на яйцеклетки се наблюдава през първата седмица (Tatar, Promislow, Khazaeli и Curtsinger, 1996), отдалечаването от потенциалната опасност може да я удължи бъдещи възможности за яйцеклетки. За разлика от това, тъй като възможностите за чифтосване на мъжете намаляват с възрастта (вж. Ruhmann, Koppik, Wolfner и Fricke, 2018), по-възрастните мъже ще имат по-малко загуби от по-младите по отношение на бъдещото размножаване.

Отговорите на D. melanogaster и D. simulans както на специфични, така и на хетероспецифични сигнали винаги са били високи, докато D. suzukii има ниски отговори на всички източници. Krause Pham и Ray (2015) отбелязват, че по-младите плодове отделят по-високи нива на CO2 и предполагат, че ниската отзивчивост на възрастните D. suzukii би улеснила търсенето на подходящи места. В допълнение, голямото изобилие и разпределението на наличните места за хранене/яйцекладка при естествени екологични условия обикновено би довело до ниски пространствени плътности на D. suzukii, така че относителната полза, получена от реакцията на бързо разсейващия се специфичен сигнал за тревога, би била с ограничена стойност . За разлика от това относителната плътност на D. melanogaster и D. simulans ще бъде по-висока при ферментиращите плодове, така че ще има по-голяма вероятност за откриване на dSO от специфични особености в близост и реагиране на източник на опасност в близост би било изгодно.

Единственият вид, който показа по-висока реакция към специфични, а не към хетероспецифични, беше D. simulans, нещо, което човек би очаквал, ако в допълнение към CO2 в dSO има специфични за вида компоненти (Enjin & Suh, 2013; Suh et al., 2004). Дори да има видова специфичност, високият отговор на D. melanogaster и D. simulans на хетероспецифици предполага, че има достатъчно CO2, отделен от стресирани мухи, за да предизвика реакции и/или че двата вида споделят други dSO общи компоненти. Ясно е, че са необходими допълнителни изследвания, за да се установи дали в dSO има други компоненти от всеки вид и да се определи до каква степен те променят поведението на избягване. Освен това, след като всички компоненти бъдат идентифицирани, ще бъде възможно да се определи до каква степен профилите се променят с възрастта, състоянието на чифтосване или типа стрес, на който са подложени файловете. Тази информация ще бъде важна при изследване на потенциалното използване на dSO в програми за управление на вредители срещу видове като D. melanogaster, въпреки че нашите резултати показват, че такъв подход не би бил толкова ефективен срещу D. suzukii.

D. melanogaster са чудесен модел за невро-генетични изследвания поради наличието на вмъкване и делеции, които обхващат повечето от напълно идентифицирания геном, RNAi библиотеки и трансгенни линии за потискане или подобряване на експресията на определени гени (Hales, Korey, Larracuente, & Roberts, 2015). Нашите резултати осигуряват по-добро разбиране на параметрите, които трябва да бъдат взети под внимание в бъдещата работа по отношение на откриването на dSO, изследвания, които биха могли да доведат до по-добро общо разбиране на неврофизиологичните аспекти на обонянието на насекомите.

Констатациите също така показват, че редовните техники, използвани за прехвърляне на мухи, ще доведат до освобождаване на dSO и че докато обонятелната реплика се разсейва бързо, стресираните мухи могат да продължат да излъчват поне час. Тези ефекти от манипулацията могат да бъдат важен объркващ фактор при изучаване на някои аспекти на поведението, както се вижда при проучвания, изследващи агресията (Trannoy, Chowdhury, & Kravitz, 2015). Следователно бихме предложили всеки, който провежда изследвания за поведението на дрозофила, да използва подхода на светлинен отговор при прехвърляне на мухи.

КОНФЛИКТИ НА ИНТЕРЕСИ

ВНОСКИ НА АВТОРА

Събирането и анализът на данни бяха извършени от RTY, EL, ISM, SC, ISM, AFG и MS; Протоколи, разработени от AFS и JNM; първият проект е написан от RTY, EL и AFS, а окончателният - от RTY, AFS и JNM.

ЕТИЧНА ЗАБЕЛЕЖКА

Не се изисква одобрение от Комитета за грижа за животните на Western или от провинциалните и федералните регулаторни органи за изследване на безгръбначни животни. Въпреки това осигурихме подходящи условия за отглеждане и анестезирани мухи, използвайки CO2 или студена анестезия, когато манипулираме мухи за поддържане на колонията. Стресовите процедури за получаване на dSO водят до липса на смъртност

ПРИЗНАВАНИЯ

Тази работа беше подкрепена от награда за докторантура на Western Science за бакалавърска степен и вътрешна стипендия за завършили студенти за RTY, вътрешна субсидия на Western Foundation и грантове за откриване NSERC 04507-2015 за JNM и 04275-2015 за AFS. Благодарим на Иън С. Макдоналд за техническия му принос, Янира Хименес Падила и лабораторията Sinclair за осигуряването на храна за Drosophila suzukii по време на експеримента.

Бележки под линия

Тези автори са били студенти по време на събирането на данни