Ютака МАКИЗАКИ

1 R&D център, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Кобе, Хиого, Япония

предизвикан

Аяко МАЕДА

1 R&D център, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Кобе, Хиого, Япония

Йосуке ОИКАВА

1 R&D център, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Кобе, Хиого, Япония

Сая ТАМУРА

1 R&D център, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Кобе, Хиого, Япония

Йошики ТАНАКА

1 R&D център, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Кобе, Хиого, Япония

Шунджи НАКАДЖИМА

1 R&D център, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Кобе, Хиого, Япония

Хидеки ЯМАМУРА

1 R&D център, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Кобе, Хиого, Япония

Резюме

Запекът, функционално разстройство на храносмилателната система, е често срещан при деца и възрастни и може да наруши качеството на живот на пациента. Тъй като много пациенти не са доволни от ефикасността на съществуващите терапии, в това проучване ние изследвахме ефикасността на пробиотика Bifidobacterium bifidum G9-1 (BBG9-1) при запек, предизвикан от диета с ниско съдържание на фибри. След предизвикване на запек при плъхове чрез хранене с диета с ниско съдържание на фибри, плъховете са хранени с диета с ниско съдържание на фибри, смесена с BBG9-1 за 14 дни, за да се определи ефикасността на BBG9-1 за облекчаване на запека. BBG9-1 значително облекчава дисбиозата, предизвикана от диета с ниско съдържание на фибри и подобрява броя на фекалиите, теглото на фекалиите и съдържанието на фекална вода. Освен това, той също така подобри концентрацията на органична киселина в цекалното съдържание. Тези резултати предполагат, че при запек, предизвикан от диети с ниско съдържание на фибри, BBG9-1 може да облекчи дисбиозата и запека и може да подобри чревната среда, подкрепяйки потенциалното му приложение при лечение на запек.

ВЪВЕДЕНИЕ

Към днешна дата много изследвания предполагат участието на чревната флора в развитието на различни коремни симптоми и е потвърдена дисбиоза при пациенти със запек [8, 9]. Симптомите на запек се наблюдават при мишки, трансплантирани с фекална флора, получена от пациенти със запек, а също така се съобщава, че чревната флора участва в развитието на запек [10]. Пробиотиците са живи микроорганизми, които дават ползи за здравето на гостоприемника, когато се прилагат в подходящи количества [11]. В действителност се съобщава, че пробиотиците подобряват чревната флора при пациенти с различни заболявания [12] и облекчават симптомите на запек [13]. Въпреки това, подробните ефекти на пробиотиците върху дисбиозата при запек не са описани.

Пробиотикът Bifidobacterium bifidum G9-1 (BBG9-1) се оказа полезен за облекчаване на запек при плъхове, хранени с диета с ниско съдържание на фибри [14] и се използва като чревно лекарство в продължение на няколко десетилетия. Въпреки че е изследвано влиянието на BBG9-1 върху чревната флора, анализът е извършен с помощта на културни методи и не е получена подробна информация, като анализ чрез секвениране от следващо поколение.

Следователно, в това проучване имахме за цел да изясним ефективността на BBG9-1 при NTC и неговото влияние върху чревната флора чрез секвениране от следващо поколение, използвайки модел на запек, който отразява запек, причинен от недостатъчно диетични фибри.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Бактерии

В този експеримент беше използван сух BBG9-1 (брой на жизнеспособни клетки: 1.94 × 10 11 CFU/g). Сух бактериален прах е получен от Biofermin Pharmaceutical (Кобе, Япония).

Животни

Шестседмични мъжки плъхове Sprague Dawley са закупени от Japan SLC (Hamamatsu, Япония) и са аклиматизирани за 1 седмица преди употреба в експеримента. Животните бяха настанени поотделно в клетки от 5 единици от неръждаема стомана (CL-02036, W 755 × D 210 × H 170 mm; CLEA Japan, Inc., Токио, Япония) при специфични условия без патогени при стайна температура (22 ± 3 ° C) и влажност 55% ± 15%, с 12-часов цикъл светлина/тъмнина (07:00 до 19:00 часа). В допълнение, диета на прах CE-2 (CLEA Япония) беше дадена ad libitum като стандартна диета, а чешмяната вода беше свободно достъпна от бутилка за водоснабдяване. Всички тестове бяха проведени съгласно указанията за експерименти с животни на Biofermin Pharmaceutical след одобрение от комитета за експерименти с животни на Biofermin Pharmaceutical (номер на одобрение: 132-005).

Индукция и оценка на запек

Запекът се предизвиква чрез хранене с диета с ниско съдържание на фибри, базирана на стандартна храна (CE-2; Таблица 1) в продължение на 3 дни. След индукция на запек, контролната група е хранена с диета, съдържаща 10% декстрин на прах, смесен с диетични фуражи с ниско съдържание на фибри, а групата BBG9-1 е хранена с 10% BBG9-1 сух бактериален прах, смесен с диета с ниско съдържание на фибри. Нормалната група е хранена с фураж CE-2 през целия период на теста. Запекът се оценява чрез измерване на фекалните параметри (фекален брой, тегло и водно съдържание). На 14-ия ден от приложението на BBG9-1 цекумът беше отстранен под анестезия с изофлуран и съдържанието на цекума беше бързо замразено с течен азот и съхранено при -80 ° C до анализ.

маса 1.

Съставки Конкурси (%) CE-2 (стандартна диета) Диета с ниско съдържание на фибри
Влага8,899.00
Суров протеин24,8824,90
Сурова мазнина5.033.90
Сурови фибри4.630,90
Сурова пепел6.796.00
Екстракт без азот49,7855,30

Измерване на фекален номер и тегло

Броят и теглото на изпражненията на ден се измерват между 3 и 14 ден, като се използват всички изпражнения, отделяни през всеки 24-часов период, с 10:00 AM като начална точка на часа всеки ден.

Измерване на съдържанието на фекална вода

Съдържанието на фекална вода се определя чрез събиране на пресни изпражнения, отделени чрез леко свиване на корема. След измерване на теглото на изпражненията, пробите се сушат при 90 ° C в продължение на 24 часа и съдържанието на влага се изчислява, като се използва промяната на теглото преди и след изсушаването.

Измерване на pH на цекалното съдържание

РН на съдържанието на цекала, суспендирано в 9 × йонообменна вода, беше измерено с помощта на рН-метър (D-54, Horiba, Киото, Япония).

Измерване на концентрациите на органични киселини в цекалното съдържание

Концентрациите на органични киселини в цекалното съдържание са измерени съгласно метода на Nagano et al. [15].

Микробиологични анализи на цекално съдържание

За изследване на микробиотата е извършен изчерпателен анализ на 16S рРНК последователност. ДНК се извлича от цекално съдържание, използвайки метода на топче-фенол. Анализът на последователността на V3-V4 региона на гена 16S rRNA беше извършен с помощта на платформата MiSeq съгласно метода на Fadrosh et al. [16]. След това беше извършен анализ на данните за четене на последователности, получени от MiSeq, използвайки QIIME тръбопровода [17]. Четенията бяха обединени с помощта на fastq-join и беше извършено филтриране на качеството (QV ≥ 25), използвайки USEARCH v 6.1. Данните за четене, преминали филтрирането и химерната проверка за четене, бяха използвани за анализ на флората. Извличахме на случаен принцип 5000 четения за образец и създадохме оперативна таксономична единица (OTU) с 97% хомология като прагова стойност, използвайки USEAECH. Извършено е търсене на хомология за представителната последователност на OTU с помощта на UCLUST и е извършена идентификация до нивото на реда на всяко четене.

Изчисляването на различието (разстоянието на Bray-Curtis) на чревния микрофлорен състав на всяка проба беше извършено с помощта на функцията вегдист (веган пакет) на софтуера за статистически анализ R. Въз основа на получената стойност беше извършен главният координатен анализ (PCoA) функцията dsv.pco.

Статистически анализ

Получените експериментални резултати са изразени като средни стойности ± стандартни грешки. Проведохме тест за нормалност във всяка група и тествахме дисперсията, използвайки теста на Бартлет, ако се наблюдава нормално разпределение. В случаите на еднаква дисперсия данните бяха тествани с помощта на тестове на Tukey-Kramer. Ако отклоненията са разпределени неравномерно или ако не се наблюдава нормално разпределение, данните се тестват с помощта на тестове на Steel-Dwass. Резултатите с р стойности под 0,05 се считат за значими.

РЕЗУЛТАТИ

Ефекти на BBG9-1 върху параметрите на изпражненията

В контролната група се наблюдава значително намаляване на броя и теглото на изпражненията от 1 ден в сравнение с тези в нормалната група. В групата BBG9-1 се наблюдава значително увеличение на броя на изпражненията на 11-14-ия ден (фиг. 1а) и значително увеличение на фекалното тегло на 14-ия ден (фиг. 1б) в сравнение с тези в контролната група. Освен това, съдържанието на фекална вода в групата BBG9-1 е значително увеличено в сравнение с това в контролната група през всички дни (фиг. 1в).