Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

подобряване

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Alpha Genesis, Inc., Yemassee, Южна Каролина, Съединени американски щати

Фондация Югозападна фондация за биомедицински изследвания, Сан Антонио, Тексас, Съединени американски щати

Асоциация Северни биомедицински изследвания, Мускегон, Мичиган, Съединени американски щати

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Фондация Югозападна фондация за биомедицински изследвания, Сан Антонио, Тексас, Съединени американски щати

Affiliation Rinat, Pfizer Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

  • Джон С. Лин,
  • Дейвид Цао,
  • Пол Барас,
  • Раул А. Бастарахея,
  • Боб Бойд,
  • Джойс Чоу,
  • Родни Розете,
  • Хуа Лонг,
  • Алисън Форги,
  • Ясмина Абдиче

Фигури

Резюме

Загубата на функционални мутации в рецепторния път на тирозин киназа TrkB води до хиперфагия и болезнено затлъстяване при хора и гризачи. От друга страна, периферната или централна стимулация на TrkB от неговите естествени лиганди BDNF или NT4 намалява телесното тегло и приема на храна при мишки, подкрепяйки идеята, че TrkB е ключов анорексигенен сигнал надолу по веригата на меланокортин-4 рецепторната система (Mc4r). Тук показваме, че при нечовекоподобните примати TrkB агонистите са били анорексигенни, когато се прилагат централно, но изненадващо са орексигенни, което води до повишаване на апетита, телесното тегло, мастните натрупвания и нивата на серумния лептин, когато се прилага периферно. Ефектите на орексигенност и затлъстяване на периферно прилаганите TrkB агонисти изглежда са зависими от дозата, не са свързани със задържане на течности или с доказателства за регулиране на рецептора надолу. Нашите открития разкриха, че сигнализирането на TrkB упражнява двоен контрол върху енергийната хомеостаза при приматите, които могат да бъдат насочени за лечение на разстройства на загубата или затлъстяване.

Цитат: Lin JC, Tsao D, Barras P, Bastarrachea RA, Boyd B, Chou J, et al. (2008) Подобряване на апетита и увеличаване на теглото от периферна администрация на TrkB агонисти при нечовекоподобни примати. PLoS ONE 3 (4): e1900. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001900

Редактор: Садаф Фаруки, Университет Кеймбридж, Великобритания

Получено: 27 август 2007 г .; Прието: 12 февруари 2008 г .; Публикувано: 2 април 2008 г.

Финансиране: Pfizer Inc. финансира и одобри публикуването на тази работа.

Конкуриращи се интереси: JCL, JS и AR са подали заявка за патент въз основа на констатациите, описани тук.

Въведение

Извлеченият от мозъка невротрофичен фактор (BDNF) и невротрофин-4 (NT4) са два естествено срещащи се лиганди за рецепторната тирозин киназа trkB [1]. Първоначално разглеждани като трофични фактори за оцеляване на невроните и израстване на неврити по време на ембрионалното развитие, тези фактори всъщност могат да упражняват широк спектър от биологични функции при възрастни, като дългосрочно потенциране и синаптична пластичност. ИРНК на BDNF обикновено се експресира във вентромедиалния хипоталамус (VMH) [2], [3], [4], [5]. Експресията на VMH на иРНК на BDNF се намалява при няколко условия, при които апетитът е повишен, като лишаване от храна, антагонизъм на меланокортин (както при A y смъртоносни жълти мишки) и генетична аблация на меланокортин 4 рецептора (Mc4r) [3].

Мутациите на загуба на функция на BDNF или trkB локуси при мишки доведоха до синдром на хиперфагия и затлъстяване. Те включват мишки хетерозиготни с алел с дефицит на BDNF [2], [4], мишки с постнатална мозъчно-специфична делеция на BDNF [5], както и мишки с хипоморфен алел на trkB [3]. Забележително е идентифицирана мутация de novo trkB при умствено изостанало, болестно затлъстяло дете [6]. Киназната активност на този мутант човешки алел trkB е значително намалена. Освен това е установено, че случай на хиперфагия и затлъстяване при хора крие хромозомна транслокация, засягаща експресията на BDNF [7]. Освен това, както централното, така и периферното приложение на различни TrkB агонисти потискаха приема на храна и телесното тегло при няколко миши модели на затлъстяване [2], [3], [8], [9]. Тези открития заедно подкрепят идеята, че активирането на trkB от BDNF, изразено в мозъка, е от съществено значение за регулирането на апетита и енергийната хомеостаза.

За да изследваме осъществимостта на trkB агонизма като терапевтичен подход за затлъстяване при хора, проведохме поредица от експерименти, използващи NT4, BDNF и TrkB агонистично антитяло при няколко вида нечовешки примати. Както NT4, така и BDNF, когато се доставят директно в мозъка, потискат консумацията на храна при слабите маймуни. Противно на нашите очаквания обаче, агонистичните антитела NT4 и TrkB значително повишават приема на храна, телесното тегло, мастната маса и нивата на циркулиращ лептин при слабите маймуни и дори при затлъстелите павиани. По-нататъшен анализ предлага нова, периферно достъпна, орексигенна TrkB система, която, когато се активира, може да балансира централната, анорексигенна TrkB система.

Резултати

Администриране на TrkB агонисти Резултат от хипофагия и отслабване при мишки

Тъй като NT4 има много подобен агонистичен профил като BDNF [10], [11], [12], ние използваме тези два фактора поотделно и взаимозаменяемо като естествените, TrkB агонистични агенти. Ежедневното интравенозно (IV) лечение на диета, предизвикано от затлъстяване (DIO), модел на мишка с 0,6, 2 или 4 mg/kg NT4 доведе до дозозависимо намаляване на приема на храна (фиг. 1а) и телесно тегло (фиг. 1б). Намаляване на теглото се наблюдава и в Ден 11 след седмични интравенозни инжекции от 2 mg/kg BDNF, 2 mg/kg NT4 (фиг. 1в) или еднократна интравенозна инжекция от 3 mg/kg TrkB селективно агонистично антитяло (фиг. 1г; Tsao et al, 2007; за повече подробности относно генерирането и характеризирането на TrkB агонистично антитяло вижте също Допълнителни методи S1, допълнителни фигури S1 – S2 и допълнителна таблица S1). Ежедневното подкожно (SC) лечение на 12 седмици затлъстели женски db/db мишки с 20 mg/kg NT4 (n = 8 на група) в продължение на 30 дни също доведе до трайно 50–80% намаляване на дневния прием на храна (Фиг. 1е) и линейно зависимо от времето, 40% намаление на телесното тегло (фиг. 1е), потвърждаващо, че активирането само на TrkB причинява анорексия и загуба на тегло при гризачи, независимо от лептиновия сигнал [9]. Не се наблюдава толерантност, десенсибилизация, адаптация или резистентност към продължителното излагане на висока доза NT4 при тези условия на лечение.

a, Ежедневно IV инжектиране на 0,6, 2 или 4 mg/kg NT4 (n = 6 на група) води до намаляване на дозата на средния дневен прием на храна в продължение на 5 дни при възрастни мъжки DIO мишки (Еднопосочен ANOVA, P = 0,0098, F = 4,967 с последващия тест на Dunnett, P Фигура 2. Централно, но не и периферно доставени TrkB агонисти потискат приема на храна при резус маймуни.

a, Инфузията на превозни средства в нормални възрастни маймуни резус (изходно телесно тегло 4–7 kg) чрез ICV катетър не променя съществено консумацията на храна (n = 2 мъже и 2 жени на група). b, Дозозависимо и обратимо намаляване на приема на храна, последвано от инфузия на ICV в нормални възрастни маймуни резус с нарастващи дози NT4 или BDNF (n = 2 мъже и 2 жени на група). c, Ежедневни SC инжекции от 2 mg/kg NT4 (n = 1 мъжки и 2 женски на група) в продължение на 21 дни в слаби, възрастни маймуни резус (изходно телесно тегло 3–6 kg) не променят значително нивото на дневния прием на храна.

Периферното приложение на TrkB агонисти води до хиперфагия и увеличаване на теглото при маймуните

a – d, Ежедневно лечение на затлъстели възрастни жени, Cynomolgus (изходно телесно тегло 3–5 kg) с 2 mg/kg/ден NT4 IV (n = 3 на група) в продължение на 30 дни доведе до значително увеличение на дневните прием на храна (a), кумулативен прием на храна (b) и телесно тегло (c) без значителна промяна в приема на вода (d). e – f, слаби, възрастни женски маймуни Cynomolgus (n = 3 на група), които са лекувани два пъти седмично с IV инжекции от 5 mg/kg TrkB агонистично антитяло, показват значително увеличение на кумулативния прием на храна (e) и наддаване на тегло (е)

За да се провери дали TrkB активирането само по себе си е достатъчно за предизвикване на затлъстяване и апетит, слаби възрастни маймуни Cynomolgus са лекувани два пъти седмично с IV инжекции от 5 mg/kg от TrkB агонистично антитяло. Тези маймуни също демонстрират 40% увеличение на кумулативния прием на храна (фиг. 3д) и 10% увеличение на телесното тегло (фиг. 3е) в рамките на 2 седмици. По този начин активирането на TrkB тирозин киназния рецептор чрез периферно приложение на естествен агонист, NT4 или от TrkB агонистично антитяло, води до мощни орексигенни и про-затлъстяващи ефекти при приматите.

Периферните инжекции NT4 увеличават консумацията на храна, телесното тегло, мастната маса и циркулиращия лептин при затлъстели бабуини

За да се определи общността и ефективността на периферните TrkB агонисти като орексигенен сигнал при примати, възрастни затлъстели женски павиани се инжектират интравенозно с 2 mg/kg NT4 дневно в продължение на 25 дни. Въпреки затлъстяването на изходно ниво, всички лекувани с NT4 животни увеличиха дневния си прием на храна с 2 до 3 пъти (фиг. 4а) и консумираха цялата дневна доза храна от 35 бисквити до 18 дни. Когато надбавката за храна беше увеличена до 45 бисквити на ден (ден 19 до ден 25), две от животните все още консумираха цялата добавка (допълнителна фигура S7a). Кумулативният прием на храна по време на лечението с NT4 е увеличен с 2,5 пъти (допълнителна фигура S7b). Хиперфагичното поведение отшумя в рамките на 7 дни след последната доза NT4 (Фиг. 4а). Ежедневната инфузия на NT4 също води до 16% увеличение на телесното тегло при тези затлъстели бабуини, на които са били необходими повече от 30 дни, за да се върнат на изходно ниво след отнемане на лечението (Фиг. 4б). В съответствие с наддаването на тегло, тези лекувани с NT4 бабуни показват значително по-високи серумни нива на лептин на гладно (9433 ± 841 pg/ml, n = 3) от тези в контролната група (2707 ± 1603 pg/ml, n = 3) след 3 седмици на лечението (P Фигура 4. Ефекти на TrkB агонистите върху апетита и теглото при затлъстелите бабуини.

a – d, ежедневна IV инфузия на 2 mg/kg NT4 в продължение на 25 дни в затлъстели бабуини (изходно телесно тегло 20–30 kg, n = 3 на група) води до обратимо увеличение на приема на храна (a) и телесно тегло ( б). Сканирането с двойна рентгенова абсорбциометрия (DEXA) разкрива увеличение на общите мазнини (c), без промяна в чистата телесна маса (d). e – f, IV дозиране два пъти седмично с 2 mg/kg NT4 за период от 6 седмици води до увеличаване на теглото (f) без значителна промяна в приема на храна (e) при затлъстели бабуини (n = 3 на група). g, Схематичен модел, изобразяващ двойните, анорексичните и орексигенните оси на сигналната система TrkB.

Сканирането с двойна рентгенова абсорбциометрия (DEXA) разкрива дълбокия ефект на лечението с NT4 върху телесния състав (фиг. 4в и 4г). Третираните с NT4 бабуини са спечелили 1,65 ± 0,31 kg (средно ± SEM), докато бабуните, третирани с превозно средство, са загубили 1,36 ± 0,47 kg от общата мастна маса (Фиг. 4в, P = 0,01, двустранен t-тест на Student с корекция на Welch). Няма значителна разлика в чистата телесна маса (фиг. 4г, Р = 0,10) или в костната минерална плътност (данните не са показани) между групите. Следователно, периферното активиране на TrkB води до мощен орексигенен ефект, което води до увеличаване на телесното тегло и мастната маса дори при нечовешки примати със съществуващо затлъстяване.

Ефектите при затлъстяване при периферни инжекции NT-4 не се дължат на десенсибилизация на рецептора

Формално беше възможно хроничното излагане на мощни TrkB агонисти да е довело до понижаване на регулацията на TrkB рецептора и следователно до фенотип на загуба на функция. Следователно ние изследвахме ефекта на интермитентно, два пъти седмично IV дозиране с приложение на 2 mg/kg NT4 при затлъстели бабуини за период от 6 седмици. Третираните животни постепенно натрупват до 7–8%, докато групата носители губи средно 3–4% от телесното тегло, което води до значителна разлика между тези групи (фиг. 4е). Никаква съществена промяна в приема на храна обаче не придружава наддаване на тегло (Фиг. 4д).

Подобният ефект на затлъстяване след ежедневно или два пъти седмично дозиране на NT4 (фиг. 4а-е), който при примати има полуживот по-малък от 30 минути (данните не са показани), е несъвместим с хипотезата на TrkB регулиране на рецептора надолу. По същия начин не са открити последователни промени в нивата на TrkB рецептор в бабуиновите периферни бели кръвни клетки, които биха могли да показват регулиране на рецептора надолу, след 24 дневни IV терапии с 2 mg/kg NT4 (допълнителна фигура S7c). И накрая, в съответствие с тези наблюдения при примати, няма доказателства за толерантност, десенсибилизация или резистентност към TrkB при каквито и да е модели на мишки с каквито и да е дозирани TrkB агонисти, които сме тествали (Фиг. 1). Тези открития показват, че ефектите от затлъстяването на периферно прилагания NT4 не се медиират от регулиране на рецептора надолу и че периферното приложение на NT4 може директно да намали скоростта на метаболизма, независимо от ефекта му върху приема на храна при нечовешките примати.

Дискусия

Констатациите, описани тук, предполагат съществуването при приматите на нова, периферно достъпна, орексигенична и затлъстяваща ос TrkB, която се противопоставя на традиционната, централно разположена анорексигенна ос TrkB (фиг. 4g). И двата рамена на системата използват сигналния път на TrkB и крайният резултат от метаболизма ще бъде определен от относителната сила на диференциално локализираните TrkB сигнали. Доколкото ни е известно, това представлява първият пример при приматите за диаметрално противоположни метаболитни и поведенчески резултати, медиирани от един и същ сигнален път чрез пространствено разделяне. Понастоящем анатомичните места на действие за периферно достъпния, орексигенен TrkB сигнал не са известни, но могат да включват ентеричната нервна система, панкреатичната и чревната невро-ендокринна система, вагусния нерв и/или околокръговидните органи.

Изглежда, че състоянието по подразбиране на системата TrkB в цялото тяло е анорексигенно, както показва фактът, че гризачите [2], [3], [5] или хората [6], [7], носещи алел на загуба на функция на BDNF или TrkB локус проявява затлъстяване и хиперфагия в началото. Въпреки това, анорексигенният TrkB стимул, който се медиира от BDNF в VMH, е под диетичен контрол и е доказано, че е потиснат след гладуване при мишки [3]. Следователно, при дадено физиологично състояние, или централната анорексигенна, или периферната орексигенна TrkB система може да доминира в метаболитния резултат в зависимост от относителните нива на рецепторно активиране (Фиг. 4g). Периферно достъпната, орексигенна ос TrkB или липсва при гризачи, или е била количествено маскирана от по-доминиращата, централна анорексигенна ос TrkB, която при малки животни може да бъде по-достъпна за периферно прилаганите агонисти на TrkB рецептор [13].

Интересното е, че възрастните пациенти с анорексия нервна болест показват по-ниски от нормалните серумни нива на BDNF, докато затлъстелите възрастни имат по-високи от нормалните серумни нива на BDNF [14], [15], [16], [17]. Досега тези открития бяха интерпретирани като неуспешен компенсаторен отговор на централната анорексигенна TrkB система, аналогичен на този, наблюдаван при лептиновата система [18], [19]. Нашите данни сега повишават ясната възможност, че хранителните разстройства като анорексия нервна болест могат да бъдат причинени отчасти от „ненормалните“ нива на циркулиращия BDNF и произтичащата от това неспособност за активиране на периферно достъпната орексигенна ос TrkB. И обратно, затлъстяването може да се дължи отчасти на „свръхнормалните“ нива на периферния BDNF, които свръхактивират орексигенната TrkB сигнализация. Значителни количества BDNF присъстват в тромбоцитите [20] и хипофизата [21], осигурявайки потенциални източници на TrkB агонисти за периферно регулиране на орексигенната ос TrkB. Ако е вярно, селективните активатори на периферно достъпния орексигенен сайт TrkB биха представлявали нови терапевтични средства за анорексия и кахексия, докато селективните инхибитори на тази система могат да намерят полезност при лечението на хиперфагия и затлъстяване.

Методи

Допълнителни подробности за използваните материали и методи са предоставени в допълнителните методи S1.

Протеини

Рекомбинантен човешки протеин BDNF е закупен от Peprotech (Rocky Hill, Ню Джърси). Рекомбинантният човешки NT4 протеин беше пречистен и повторно нагънат от култура на Е. coli, проектирана да свръхекспресира NT4, като се използват стандартни процедури (вж. Допълнителни методи S1). TrkB агонистични антитела са генерирани, като се използва целият извънклетъчен домен на човешки TrkB протеин като имуноген в мишки Balb/c за генериране на хибридоми (вж. Допълнителни методи S1).

Изследвания върху животни

Всички експерименти с животни са проведени съгласно протоколите, одобрени от IACUC на съответните институции (вж. Допълнителни методи S1). Подробности за различни пътища на приложение на съединение, измерване на консумацията на храна и телесно тегло са описани в допълнителни методи S1. В тази статия „Ден 1“ от дадено проучване обозначава деня, когато е дадена първата доза от терапевтичен агент.

Статистика