Допринесе еднакво за тази работа с: Теофилос Путахидис, Алекс Спрингър

пробиотичните

Отдел по сравнителна медицина, Масачузетски технологичен институт, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати, Лаборатория по патология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Аристотел в Солун, Солун, Гърция

Допринесе еднакво за тази работа с: Теофилос Путахидис, Алекс Спрингър

Отдел за сравнителна медицина, Масачузетски технологичен институт, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати, Биологично инженерство, Масачузетски технологичен институт, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати

Отдел за сравнителна медицина, Масачузетски технологичен институт, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати

Отдел за сравнителна медицина, Масачузетски технологичен институт, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати

Отдел за сравнителна медицина, Масачузетски технологичен институт, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати

Отдел за сравнителна медицина, Масачузетски технологичен институт, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати

Отдел за сравнителна медицина, Масачузетски технологичен институт, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати

Партньорска лаборатория по патология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Аристотел в Солун, Солун, Гърция

Афилиации Биологично инженерство, Масачузетски технологичен институт, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати, Широки институт на MIT и Харвард, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати

Отдел за сравнителна медицина, Масачузетски технологичен институт, Кеймбридж, Масачузетс, Съединени американски щати

  • Теофилос Путахидис,
  • Алекс Спрингър,
  • Татяна Левкович,
  • Пеймин Ци,
  • Бернард Дж. Вариан,
  • Джесика Р. Лакриц,
  • Ясин М. Ибрахим,
  • Антонис Чацигиагкос,
  • Ерик Дж. Алм,
  • Сюзън Е. Ердман

Фигури

Резюме

Цитат: Poutahidis T, Springer A, Levkovich T, Qi P, Varian BJ, Lakritz JR, et al. (2014) Пробиотичните микроби поддържат младежки серумни нива на тестостерон и размер на тестисите при застаряващи мишки. PLoS ONE 9 (1): e84877. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0084877

Редактор: Стефан Шлат, Университетска болница в Мюнстер, Германия

Получено: 30 юни 2013 г .; Прието: 20 ноември 2013 г .; Публикувано: 2 януари 2014 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Националните здравни институти P30-ES002109 (награда за пилотен проект за SEE и EJA), U01 CA164337 (за SEE и EJA) и RO1CA108854 (за SEE). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Основният клетъчен източник на тестостерон при мъжките бозайници е клетката Leydig, която се намира в клъстери в интерстициума на тестисите. Производството на андроген в клетки на възрастни Leydig се регулира от сигнали, медиирани от лутеинизиращ хормон, произхождащи от оста хипоталамус-хипофизна жлеза [1]. При мъжете неизбежно намаляване на циркулиращия тестостерон се случва с увеличаване на възрастта [2] - [4]. Механизмите, управляващи това явление, остават до голяма степен неизвестни. Проучванията при хора и гризачи обаче предполагат, че ниският тестостерон се дължи на възрастови лезии в тестисите, а не на нередовен метаболизъм на лутеинизиращия хормон [1], [5] - [7].

Намаляването на тестостерона е свързано с много неблагоприятни ефекти на стареенето при мъжете, включително намалена сперматогенеза, либидо и сексуална функция, повишени телесни мазнини, намалена мускулна и костна маса, ниски енергийни нива, умора, лошо физическо представяне, депресивно настроение и нарушено когнитивна дисфункция [8] - [11]. Дали ниският тестостерон може да се счита за причина за определена клинична единица при мъже в напреднала възраст или не е било въпрос на дебат [12]. Освен това са използвани различни наименования за описание на това състояние (мъжка менопауза, андропауза, частичен андрогенен дефицит на застаряващия мъж и късно настъпващ хипогонадизъм) и са използвани различни критерии за определянето му, поради което несъответствията в епидемиологичните проучвания по време на докладването на разпространение [12] - [13]. Независимо от това, има несъмнен консенсус в това, че свързаните с възрастта прогресивни морфологични и функционални промени на клетките на Лейдиг водят до ниски нива на тестостерон, които от своя страна намаляват репродуктивната годност и влияят върху качеството на живот на застаряващия мъж [1], [4] - [5], [9] - [10], [12] - [13].

Доказано е, че различни диетични фактори и индуцирано от диетата затлъстяване увеличават риска от мъжки хипогонадизъм с късен старт и ниско производство на тестостерон както при хора, така и при мишки. Дефицитът на тестостерон и метаболитните заболявания, като затлъстяването, изглежда се размножават в сложни причинно-следствени връзки [14] - [17].

Наскоро установихме, че хранителната добавка на възрастни мишки с пробиотичната бактерия Lactobacillus reuteri ги кара да изглеждат по-млади от съответстващите им нелекувани братя и сестри, поне отчасти чрез индуциране на благоприятни покривни ефекти, които се проявяват като пищна коса [18] и инхибиране на диетично затлъстяване [19]. Интересното е, че и двата ефекта са свързани с CD4 + регулаторна Т-клетка и свързано с Il-10 системно понижаване на провъзпалителния цитокин Il-17 [18] - [19]. Тези резултати показват, че чревната микробиота индуцира модулация на местния стомашно-чревен имунитет, което води до системни ефекти върху имунната система, които активират метаболитните пътища, които възстановяват тъканната хомеостаза и цялостното здраве. В действителност, в друго проучване открихме, че възрастните мишки, хранещи се с L. reuteri, показват ускорено заздравяване на кожни рани, което зависи от потискащото рамо на имунната система и регулирането на невропептидния хормон на хипофизната жлеза окситоцин (ръкопис, изпратен за публикуване). По време на всички тези проучвания ние постоянно наблюдаваме, че млади и възрастни мишки, консумиращи пречистени организми L. reuteri, имат особено големи тестиси и доминиращо мъжко поведение.

Нашите предишни проучвания и наблюдения, взети заедно, ни накараха да предположим, че диетичният L. reuteri може да действа за предотвратяване на свързана с възрастта и затлъстяването атрофия на тестисите при мишки. Резултатите от настоящото проучване потвърдиха тази хипотеза. Тестисите на възрастни мишки, хранени с пробиотици, бяха спасени както от атрофия на семенни тубули, така и от намаляване на площта на интерстициалната клетка на Leydig, типично за нормалния процес на стареене. Запазването на тестикуларната архитектура въпреки напредналата възраст или диетата с високо съдържание на мазнини съвпадна със забележително високите нива на циркулиращ тестостерон. Благоприятните ефекти от консумацията на пробиотици бяха рекапитулирани от изчерпването на провъзпалителния цитокин Il-17.

Като се има предвид задълбочения спор за ползите и рисковете от странични ефекти от заместителната терапия с тестостерон [9] - [10], [13], [20], диетичният L. reuteri може да осигури алтернативен естествен подход за профилактика на мъжете с късно начало хипогонадизъм.

Резултати

Консумацията на Lactobacillus reuteri увеличава тестисите на тестисите на мишки, хранени с нормална диета

а. Брутен външен вид на безпородни швейцарски мъжки мишки с орално лечение с Lactobacillus reuteri на 12-месечна възраст. Тестисите на мишки, хранени с L. reuteri, са по-големи в сравнение с контролните мишки. бъда. Резултати от статистически анализи на теглото на тестисите в различни моменти от време след започване на лечението, включително (б) 5, (° С) 7, (д) 9 и (д) 12-месечни възрастови точки. L. reuteri постоянно увеличава теглото на тестисите както при контролните, така и при новите мишки, хранени със западна диета, в сравнение с контролите, съответстващи на възрастта и диетата. Диетичните добавки с L. reuteri, но не и с E coli K12, увеличават тестисите на тестисите при мишки, хранени с контролна диета на възраст 7 месеца в сравнение с контролите, съответстващи на възрастта и диетата (° С). Числата по оста y на стълбовидните графики съответстват на средната стойност ± SEM от теглото на тестисите или теглото на тестисите; * p Фигура 2. Диетичен L. reuteri увеличава площта на профила на напречното сечение на семенните тубули и тяхната популация на зародишни клетки.

а. Представителна хистология на профили на напречни сечения на семенни тубули на швейцарски мишки на възраст 5 месеца. Повишено тегло на тестисите поради консумацията на L. reuteri както при мишки, хранени с контролна група, така и при хранене с New Western (NWD), съществува едновременно с хистологично забележимо увеличение на напречното сечение на семенните тубули (ST). Хематоксилин и еозин. Пръчки = 100 µm. б. Хистоморфометрична оценка на кръговия размер на профилите на напречното сечение на ST в различни времеви точки. Ефектът на L. reuteri остава силно значителен с напредването на възрастта. Числата по оста y на стълбовите графики съответстват на средната стойност ± SEM от размера на площта на ST; *** p Фигура 3. Консумацията на L. reuteri увеличава размера на интерстициалните области на клетките на Leydig и броя на клетките на Leydig.

а. Представителна хистология на швейцарски мишки тестиси на възраст 12 месеца. Клетките на Leydig в тестикуларния интерстициум на мишки, хранени с пробиотици, са с увеличен размер в сравнение със съответните зони на контролните мишки. Хематоксилин и еозин. Пръчки = 100 µm б. Хистоморфометричните преброявания на клетките на Leydig в различни времеви точки разкриват статистическата значимост на ефекта на L. reuteri. Числата по оста y на стълбовидните графики съответстват на средната стойност ± SEM от размера на площта на Leydig. ° С. Броят на стереологичните преброявания на точки разкрива, че тестисите на мишки, хранени с L. reuteri, са увеличили значително ядрените обеми и увеличения брой клетки на Leydig на тестис. Числата по оста y на стълбовидните графики съответстват на средната стойност ± SEM на „Ядрен обем на зародишни клетки на единица площ“ или „абсолютен ядрен обем на зародишни клетки“; * p Фигура 4. L. reuteri увеличава клетъчната пролиферация на Leydig и нивата на серумен тестостерон.

а. На възраст от 5 месеца в интерстициума на тестисите (стрелки) съществува малък брой пролифериращи (Ki-67 +) Leydig клетки. Пролифериращите клетки на Leydig са значително повече при мишки, хранени с пробиотици. DAB хромоген, хематоксилиново оцветяване. Пръчки = 25 µm. Оста y на стълбовидната диаграма означава средната стойност ± SEM на клетките Ki-67 + Leydig. б. Нивата на серумен тестостерон са значително по-високи при консумация на L. reuteri в сравнение с контролите им, съобразени с диетата. Числата по оста y съответстват на средната стойност ± SEM на нивото на серумен тестостерон в ng/ml .; * p Фигура 5. Диетичен L. reuteri спасява мишки от свързана с възрастта атрофия на тестисите.

а. Представителна хистология на швейцарски тестиси на мишки на възраст 12 месеца. Възрастните контролни миши тестиси демонстрират атрофични семенни тубули. За разлика от това, мишките, хранени с L. reuteri, имаха еднакво нормален ST епител с редки атрофични тубули. Хематоксилин и еозин. Пръчки = 100 µm. Оста y в стълбовидната диаграма означава средната стойност ± SEM на съотношението атрофично/общо ST, отчетено във всяка експериментална група; ** p Фигура 6. Системно изчерпване на IL-17 рекапитулира репродуктивните атрибути на годност на L. reuteri.

В сравнение с фиктивни мишки, третирани с IgG, 12-месечни мишки, лишени от IL-17A а. увеличено сдвоено тегло на тестисите; б. увеличени площи на ST в напречно сечение; ° С. увеличен обем на ядрените зародишни клетки; г и д. увеличени интерстициални области на Leydig клетки. Хематоксилин и еозин. Пръчки = 100 µm; е. увеличен обем на ядрените клетки на Leydig и общ брой на тестис и ж. намалена атрофия на ST. * p 5 организма/мишка/ден, или фалшива E coli K12 3,5 × 10 5 организма/мишка/ден в питейна вода. Питейната вода се подменяла два пъти седмично.

Системно изчерпване на Интерлевкин-17А с използване на анти-цитокинови антитела

Мишки на възраст 6 месеца или повече са били лекувани с интраперитонеална инжекция на анти-IL17A антитяло (клон 17F3; BioXcel, Ливан, NH) при 500 ug на мишка три пъти седмично в продължение на поне четири седмици. След това мишките бяха евтаназирани и сравнени с мишки, съпоставени с възрастта, които са получили само изотипно съвпаднало фиктивно IgG антитяло.

Измервания на серумен тестостерон

Терминалните сърдечни кръвни проби се извършват при евтаназия в средата на следобеда, за да се нормализира ефектът от циркадния ритъм върху тестостерона. RadioImmunoAssay (RIA) беше извършен с помощта на Coat-A-Count Total Testosterone RIA kit (Siemens Diagnostics CA), както се извършва от AniLytics Inc (Gaithersburg MD).

Количествено определяне на качеството на спермата

След хуманна евтаназия с използване на С02, двата тестиса бяха изолирани, за да се отстранят комбинираните епидидимални и съдови тъкани от определена мъжка мишка. Тъканта веднага се поставя в пластмасова чаша на Петри и се потапя в 1 ml FHM разтвор (специална среда, Millipore). Под дисекционен микроскоп сперматозоидите бяха мобилизирани от всеки епидидим и семепроводи с помощта на микродисекция с 16 G игла. Ястието се поставя в CO2 инкубатор при 37 ° С за 10 минути, за да се осигури пълна мобилизация на сперматозоидите. След това сперматозоидите бяха суспендирани 1-10 с FHM, за да се оцени концентрацията на сперматозоидите с помощта на хемоцитометър (Fisher). Концентрацията на сперматозоиди/ml се изчислява, като се използва (Фактор на разреждане) × (брой на броя в 5 квадрата) × (0,05 × 106). Активността на сперматозоидите се оценява като брой активно движещи се сперматозоиди/общ брой на сперматозоидите [54] - [56].

Хистопатология и имунохистохимия

За хистологична оценка тестисите бяха фиксирани в неутрално буфериран формалин, нарязани напречно наполовина, вградени в парафин и нарязани на 4 µm или на 10 µm за стереология. Серийните срезове бяха оцветени с хематоксилин и еозин и имунохистохимия (IHC). За IHC бяха използвани заешки моноклонални анти-Ki-67 (Cell Marque, Rocklin, СА) или поликлонални анти-разцепени каспаза-3 (Cell Signaling, Beverly, MA). Индуцирано от топлина извличане на антиген се извършва с разтвор за извличане на епитоп CC1 (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) за ki-67 или с цитратен буфер рН6 за каспаза-3.

статистически анализи.