Хосе Л. Валевски

1 катедра по медицина, Медицински център на Колумбийския университет, Ню Йорк, Ню Йорк 10032

Fengxia Ge

1 катедра по медицина, Медицински център на Колумбийския университет, Ню Йорк, Ню Йорк 10032

Харисън Лобдел, IV

1 катедра по медицина, Медицински център на Колумбийския университет, Ню Йорк, Ню Йорк 10032

Нанси Левин

2 CovX Pharmaceuticals, Сан Диего, Калифорния 92121

Гари Дж. Шварц

3 катедра по физиология, Медицински колеж Алберт Айнщайн, Бронкс, Ню Йорк 10461

Йосиф Васели

4 Нюйоркският изследователски център за затлъстяване, болница Сейнт Лука, Ню Йорк, Ню Йорк 10025

Afons Pomp

5 катедра по хирургия, Медицинският център Weil-Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк 10021

Грегъри Дакин

5 катедра по хирургия, Медицинският център Weil-Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк 10021

Пол Д. Берк

1 катедра по медицина, Медицински център на Колумбийския университет, Ню Йорк, Ню Йорк 10032

Свързани данни

Резюме

Обективен

Изследванията с микрочипове идентифицират Ch12: orf39 (Spexin) като най-дисрегулирания ген в затлъстелите човешки мазнини. Затова изследвахме неговата роля в патогенезата на затлъстяването.

Проектиране и методи

Ефектите на спексин върху приема на храна, схемите на хранене, телесното тегло, съотношението на респираторния обмен (RER) и двигателната активност се наблюдават по електронен път при мишки C57BL/6J или плъхове Wistar с диетично затлъстяване (DIO). Определени са неговите ефекти върху усвояването на адипоцитен [3Н] -олеат.

Резултати

При хората експресията на гена Spexin е регулирана надолу 14,9 пъти в затлъстелите оментални и подкожни мазнини. Циркулиращият спексин се променя паралелно, корелирайки (r = -0,797) с лептин. При плъхове Spexin (35 μg/kg/ден s.c) намалява калорийния прием

32% със съответна загуба на тегло. Моделите на хранене не бяха засегнати. При мишки Spexin (25 μg/kg/ден i.p.) значително намалява RER през нощта и увеличава движението. Инкубацията на спексин in vitro значително инхибира улесненото поемане на мастна киселина (FA) в адипоцитите на DIO мишки. Кондиционираното тестване за отвращение на вкуса (70 μg/kg/ден i.p.) не показва неблагоприятни ефекти на Spexin.

Заключения

Експресията на гена Spexin е значително регулирана в затлъстелите човешки мазнини. Пептидът води до загуба на тегло при DIO гризачи. Ефектите му върху апетита и енергийната регулация вероятно са централни; тези, приемащи адипоцити FA, изглеждат директни и периферни. Spexin е нов хормон, участващ в регулирането на теглото, с потенциал за терапия на затлъстяването.

ВЪВЕДЕНИЕ

Очаква се световната епидемия от затлъстяване да остане едно от най-големите предизвикателства за общественото здраве през 21 век. В частност САЩ преживява епидемия от затлъстяване с дълбоки последици (1), напр.

300 000 смъртни случая годишно (2), намаляване на продължителността на живота (3) и огромни разходи за здравеопазване (4). Затлъстяването е свързано с добре документирано увеличаване на разпространението на много състояния, които причиняват прекомерна заболеваемост и смъртност (5).

Бялата мастна тъкан (WAT) играе основна роля в съхранението на енергия. В допълнение, отделните депа за WAT също функционират като „ендокринни органи“ чрез секретиране на уникални профили на адипокини, разнообразна колекция от повече от 50 цитокини, хемокини и хормоноподобни фактори, които допринасят за поддържането на енергийната хомеостаза. Въпреки че не се експресират изключително от WAT, някои локално секретирани адипокини влияят върху апетита, ситостта и метаболизма на глюкозата и липидите (6). Действията на много от тези адипокини са интегрирани в крайна сметка за регулиране на глюкозния и енергийния метаболизъм, поемането и съхранението на мастни киселини с дълги вериги (LCFA) и инсулиновата активност чрез паракринни и ендокринни механизми.

От 2008 г. изследванията в нашата лаборатория с микрочипове, сравняващи експресията на гени при затлъстели и не-затлъстели човешки оментални и подкожни мазнини, идентифицират както отделни гени, така и биологични пътища, чиито компоненти са значително нарушени в затлъстяването. Сред най-ранните ни проучвания, използващи масиви със сонди за

Идентифицирахме 55K гени и EST

3 500 гена и EST, които показват значителни разлики в експресията (7). От тях най-регулираният надолу ген е Ch12: orf39, чиято иРНК е под-експресирана 14,9 пъти в затлъстелите мазнини. Изглежда, че кодира секретиран пептид, който впоследствие признахме, че е идентичен със Spexin, нов пептид, идентифициран от Mirabeau et al през 2007 г., използвайки моделиране на Марков (8).

Че Spexin е единственият най-регулиран надолу ген в затлъстелите човешки мазнини, заедно с наблюденията на Mirabeau et al, че Spexin индуцира мускариноподобни контракции в гладката мускулатура на стомаха in vitro (8), ни накара да предположим, че той може нормално да функционира като експресиран с адипоцити фактор на ситост и че липсата на експресия на Spexin чрез затлъстяване на мазнини може да доведе до загуба на ключов адипокин, потенциално участващ в регулирането на подвижността на червата, приема на храна, енергийния метаболизъм и поемането и съхранението на мастни киселини с дълги вериги (LCFA) в адипоцитите. Поради това ние се заехме да дефинираме неговата биологична роля в моделите на гризачи при диета, предизвикано от затлъстяване.

МЕТОДИ

Пациенти

Пациентите, подложени на клинично показани коремни лапароскопски хирургични процедури, се съгласиха за отстраняване на проби от мастна и подкожна мазнина за изследвания на LCFA транспорта, молекулярни изследвания и проба от венозна кръв за измерване на циркулиращите адипокини. Пациентите с наднормено тегло са били подложени на бариатрични хирургически процедури, а пациентите с наднормено тегло са били подложени на други клинично показани лапароскопски процедури в пресвитерианските кампуси на Weill Cornell или Columbia презвитерианската болница. Протоколите, документите за съгласие и процедурите за тези проучвания са одобрени от отделните институционални съвети за преглед на университета в Колумбия и медицинските центрове Weill Cornell.

Материали

9,10- [3 H] -олеинова киселина (OA) е закупена от NEN Life Science Products (Бостън, Масачузетс, САЩ), тип I колагеназа от Sigma (Сейнт Луис, МО, САЩ) и говежди серум без мастни киселини албумин (BSA) от Boehringer Mannheim (Индианаполис, IN, САЩ).

Използвани са два препарата на Spexin: първият от Phoenix Pharmaceuticals (Burlingame, CA) и вторият, продукт за синтез по поръчка от Ferring Research Institute (Сан Диего, Калифорния). И двете бяха> 99% чисти от HPLC и идентифицирани от LC/MS.

Изолиране на адипоцити

Адипоцитите от биопсии на човешки оментални и подкожни мазнини (9) и от епидидимни мастни възглавнички на затлъстели мишки (на възраст 18 седмици) (10) бяха изолирани и оразмерени чрез микроскопия с пряка светлина, както е описано (9, 10).

Изследвания на кинетиката на поглъщане на LCFA

Първоначалната скорост на усвояване на [3H] -OA от човешки и миши адипоцити се определя чрез бързо филтриране (9, 11). Концентрацията на несвързания олеат ([OAu]) във всеки тестов разтвор се изчислява от моларното съотношение OA/BSA (11) (12), като се използват константите за свързване LCFA/BSA на Spector et al (13). Приспособяване на данни използва програмата SAAM II на Берман и Вайс (14).

Статистически съображения

Стойностите за физиологичните променливи, освен ако не е отбелязано друго, се отчитат като средна стойност ± стандартна грешка и се изчисляват съгласно стандартните методи на описателната статистика (15). Значимостта на разликите между групите е оценена с двустранни t тестове на Student, като p ≤ 0,05 се счита за значима.

Изследвания на генната експресия

Микрочипове на целия човешки геном

Експресията на гени в проби от оментална и подкожна мазнина от затлъстели спрямо не-затлъстели лица е сравнена чрез анализ на микрогени на целия геном, както е описано по-подробно по-рано (7). Средната нормализирана информация за генната експресия (произволни експресионни единици) беше анализирана с помощта на пакета GeneSifter Data, със статистическа обработка на резултатите, както беше съобщено по-рано.

qRT-PCR

Експресията на ген Spexin беше изследвана в същите проби от мастна тъкан и допълнителни затлъстели и не-затлъстели човешки мастни тъкани чрез qRT-PCR, съгласно методите, докладвани по-рано (7). Праймерите Spexin за PCR са проектирани с помощта на софтуера Primer 3 (v.0.4.0) на http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm. Подобни методи бяха използвани за тестване на експресията на ген Spexin в мастните епидидимни мастни тъкани. Специфични праймерни последователности както за човешки, така и за миши Spexin са представени в допълнителна таблица 1. 18S РНК е използвана като контрола за нормализиране на генната експресия. Средната промяна в гънките (AFC) се изчислява, като се използва средната разлика в ΔCt между всеки тестов ген и 18S за всяка проба, т.е. AFC = 2 - (средна ΔΔCt) .

Количествени имуноанализи

Количествени имуноанализи за определяне на циркулиращите нива на Spexin чрез конкурентна EIA (Cat # EK-023-81) и човешки лептин чрез антиген улавяне ELISA (Cat # EK-003-12) бяха извършени с комплекти, закупени от Phoenix Pharmaceuticals (Burlingame, CA). Неизвестните проби се измерват в два екземпляра и стойностите на OD се определят количествено чрез сравнение със стандартните криви в рамките на анализа. Количествената валидация също се потвърждава чрез експерименти с "добавяне", при които известни количества стандарт Spexin се добавят към отделни серумни проби (вж. Допълнителни данни).

Метаболитни оценки при DIO мишки

Измерванията на метаболизма и поведението бяха извършени, както е описано по-рано (16). Индивидуално настанени мишки C57BL/6J с индуцирано затлъстяване (DIO) или контроли, съобразени с възрастта (Jackson Labs, Bar Harbor, ME, USA), бяха поддържани по желание на диета с високо съдържание на мазнини (HFD, D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ), които осигуряват 60% от общите калории като мазнини.

24-часово поведение при хранене при плъхове DIO

Затлъстели (DIO) възрастни женски плъхове Wistar се поддържат ad lib на 60% HFD (D12492) в отделни камери, в които тяхното поведение на хранене е непрекъснато регистрирано чрез BioDaq електронна система за наблюдение на приема на храна (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ).

Условни проучвания за отвращение на вкуса при плъхове

Проведени са проучвания за неприязън на кондициониран вкус, използвайки възрастни женски плъхове Wistar, съгласно установените протоколи (17-19). За тренировка плъховете бяха вода, но не и храна, лишени за 20 часа (18:00 -14: 00 часа на следващия ден), след което предлагаха една бутилка вода ad libitum за 20 минути. Обучението се провежда на 2 дни от всяка седмица, на интервали от 3-4 дни, за да се позволи възстановяване на нормалния прием на храна и телесното тегло. Проведени са общо 7 тренировъчни сесии, по това време всички животни са се научили да пият веднага, когато им се предлага течност.

РЕЗУЛТАТИ

Профилиране на генна експресия на човешки мазнини

Експресията на гени в проби от оментална и подкожна мазнина от субекти със затлъстяване спрямо нормално тегло е сравнена чрез анализ на микрочипове на целия геном (7). Средните нормализирани съотношения на експресия на гени за всяка сонда, представляващи 55K известни гени и EST, бяха сравнени чрез log-log plot ( Фигура 1А ). ИРНК за Ch12, ORF39 (Spexin) демонстрира силно значителен 14,9-кратен спад в експресията при затлъстели в сравнение с не-затлъстели мастни тъкани ( Фигура 1В ), най-голямата промяна в генната експресия, наблюдавана при затлъстели човешки мазнини (p = 0,00292).

spexin

А) Анализ на микрочипове на целия геном на мазнини без затлъстяване спрямо затлъстяване (log-log plot): цветните точки представляват гени със значителни разлики (p Фигура 1C ; p Фигура 2А ). В допълнение, концентрациите на Spexin са значително отрицателно корелирани ( Фигура 2Б ) и концентрациите на лептин положително корелират ( Фигура 2С ) с Vmax за усвояване на LCFA от маточни адипоцити от същите пациенти. Концентрациите на циркулиращ спексин също са измерени при 20-седмични DIO мишки (2,24 ± 0,07 ng/mL, n = 17) и контролни фонови контроли на C57BL5/6J, съответстващи на възрастта (4,28 ± 0,48 ng/mL, n = 5) (Допълнителна фигура 1Б). Както при човешките проби, концентрациите на циркулиращ спексин са значително по-високи при не-затлъстелите контролни мишки, отколкото при затлъстелите DIO животни (p Фигура 3). В паралелни проучвания, в които също се измерва консумацията на храна, консумацията на храна постепенно намалява с течение на времето при третирани със Spexin мишки, но остава по същество непроменена в контролите, третирани с PBS (Допълнителна фигура 2). За разлика от затлъстелите мишки DIO, мишките C57BL/6J с нормално тегло не отслабват, когато се лекуват с подобни дози Spexin.

Възрастни мъжки мишки C57BL/6J DIO (Jackson Labs) получават ежедневни инжекции на Spexin (25 μg/kg IP в 0,1 ml 1X PBS) в продължение на 10 дни. Контролите получават ежедневни IP инжекции на превозно средство. Всички мишки са били на диета с високо съдържание на мазнини (D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ). Теглото на тялото се измерва ежедневно. Данните са средна промяна спрямо изходното тегло ± SE, (n = 5/група). Ден 1 е първият ден на инжектиране. Всички лекувани със Spexin животни постепенно отслабват (наклон = - 0,1742 g/ден, r = - 0,8901). Контролите продължават да наддават на диета с високо съдържание на мазнини (наклон = + 0,0896, r = 0,7041).

Ефекти на екзогенния спексин върху метаболитните параметри при DIO мишки

Адипоцитите, изолирани от нетретирани DIO мишки, бяха суспендирани в леден PBS до готовност за изследване. След затопляне до 37 ° С, клетките след това се инкубират в продължение на два часа или в PBS самостоятелно (контроли), или в PBS + Spexin при 10 различни концентрации, вариращи от 0,01 до 80 ng/ml. След това клетките се измиват и се определя тяхната кинетика на поглъщане на LCFA. Кривата на двуфазната реакция на дозата съответства на хормезиса (вж. Дискусия).

Ефект на Spexin върху 24-часовото поведение при хранене и телесното тегло при DIO плъхове

Женските DIO плъхове, използвани в това проучване, са имали приблизително 20% наднормено тегло за възрастта в началото на лечението. Ежедневно се измерват индивидуалните телесни тегла и общата консумирана храна. Намаляване на дневния прием на храна, наблюдавано до ден 3 (

32%) са били статистически значими в дни 4-6, последния ден на лечение и първите два дни на измиване, ( Фигура 7А ). Намаляването на телесното тегло, отбелязано на 4-ия ден, продължава и след периода на лечение ( Фигура 7Б ). Кумулативни 24-часови криви на прием на храна от това проучване са получени чрез непрекъснат запис ( Фигура 7 C-F ). В началото двете групи животни демонстрираха по същество идентично поведение при хранене. Трябва да се отбележи, че честотата на хранене и временният (светъл/тъмен) режим на хранене през 24-часовите периоди на хранене остават нормални в групата, лекувана със Spexin, през целия период на лечение и измиване. Въпреки това, както размерът на храненето (gms консумирана храна/хранене), така и продължителността на храненето (времето, прекарано в хранене/хранене) са по-малки при лекуваните със Spexin животни, които консумират приблизително 32% по-малко калории като контролни през последния ден от лечението и първите два дни след лечението.

Кондиционирано тестване за отвращение на вкуса при плъхове Wistar

Общото количество захаринов разтвор, консумирано от животни, третирани с LiCl, е значително по-малко от консумираното от физиологичен разтвор или третирани със Spexin животни ( Фигура 8 , 2-ият ден на инжектиране и след това е значително по-малък от консумирания от физиологичен разтвор или от третирани със спексин животни, ** p Фигура 2А) между лептин и спексин в серума на пациенти със затлъстяване и контрол на нормалното тегло поддържа идеята, че тези пептиди могат да играят антагонисти роли в нормалното регулиране на глада, ситостта, телесното затлъстяване и теглото, като служи като противоположни компоненти на отрицателна обратна връзка. Поради това изследвахме биологичната роля на Spexin в енергийния метаболизъм и съхранение в два модела на гризачи на диета, предизвикано от затлъстяване. Ежедневните интраперитонеални инжекции на Spexin доведоха до намаляване на консумацията на храна и телесното тегло при DIO мишки, докато инжектираните с превозни средства DIO мишки продължават да наддават. Аналогични данни са получени в отделно проучване с DIO плъхове. Липсата на забележими вкусови неприятен ефект на Spexin при официално тестване значително засилва значението на тези наблюдения.

Тези открития бяха продължени в отделни кохорти от мишки, подложени на лечение със Spexin в продължение на 19 дни, докато бяха в метаболитни камери. Изследванията на калориметричните клетки показват, че Spexin значително намалява RER, което предполага преференциално окисляване на мазнините, особено по време на тъмнина, когато разликата в RER между мишки, третирани със Spexin и третирани с носител, е била много значителна. Наблюдаваното намаляване на RER през нощта изглежда е резултат от инхибиране на нормалното повишаване през нощта на метаболизма на въглехидратите, с придружаващо преминаване към липидно окисление. Spexin също значително повишава двигателната активност, но само в Z-равнината, чрез „отглеждане“. Няма данни за случайно повишена активност на „тревожност“.

Основата за намаляването на RER и увеличаването на двигателната активност при третирани със Spexin животни остава спекулативна. Независимо от това, намаляването на приема на храна без отвращение към вкус, променен метаболизъм и повишена двигателна активност по време на приложението на Spexin предполагат, че тези ефекти могат да бъдат централно медиирани. Този въпрос ще бъде разглеждан занапред чрез изучаване на ефектите от приложението на Spexin при позитронно-емисионно томографско сканиране на мозъчната активност и на ефектите от ниската доза интрацеребровентрикуларно приложение на Spexin върху консумацията на храна и телесното тегло.

Доколкото ни е известно, ние сме първите, които демонстрират експресия на Spexin в човешката WAT, за да идентифицираме почти пълното отсъствие на Spexin експресия в човешкото затлъстяване WAT, да предположим, че Spexin има роля в нормалната регулация на функцията на мастната тъкан, включително усвояване на LCFA, че липсата на Spexin може да бъде основен компонент на хормоналната дисрегулация, наблюдавана при затлъстелите мазнини, и че пренапълването на циркулиращия Spexin може да помогне за възстановяване на нормалното поведение на хранене и енергийния баланс при затлъстелите животни и хората. Историята за Spexin очевидно тепърва започва и има много въпроси без отговор, от които ефектите на Spexin върху телесния състав са важни, но това, което е съобщено тук, очевидно движи полето напред.

Това проучване, един от резултатите от продуктивно сътрудничество между лаборатория, фокусирана върху липидния метаболизъм, и екип от бариатрични хирурзи, силно подкрепя хипотезата, че Spexin е мощен, естествен пептид, предизвикващ ситост, който играе ключова роля в регулирането на поведението при хранене, усвояването на LCFAs в адипоцити, използване на енергия и метаболизъм и телесно тегло при DIO мишки и плъхове. Неговият терапевтичен потенциал за лечение на човешко затлъстяване заслужава подробно проучване.

Това, което вече е известно по този въпрос?

Spexin е нов, наскоро описан пептиден хормон

Генът Spexin (Ch12: orf39) се преобразува в локус, свързан с различни фенотипни маркери на затлъстяването

Наскоро беше доказано, че Spexin играе роля в ситостта на златните рибки

Какво добавя това проучване?

При изследванията на микрочипове на генна експресия Spexin е пропорционално най-регулираният надолу ген в затлъстелите човешки мазнини.

Прилагането на екзогенен Spexin намалява приема на храна и телесното тегло при DIO гризачи.

Спексинът инхибира поемането на мастна киселина с дълги вериги в адипоцитите при DIO гризачи и може да бъде регулатор на поемането на LCFA в човешката мастна тъкан.