Резюме

Заден план

Известно е, че диетата с високо съдържание на мазнини има неблагоприятни ефекти върху метаболитните маркери, както и върху чревната микробиота. Ефектът от топлинната обработка на диетата с високо съдържание на мазнини, която води до образуване на усъвършенствани крайни продукти за гликиране (AGEs), не е ясно разграничен от ефекта на ненагрятите мазнини. Това проучване сравнява ефекта на диетата с високо съдържание на мазнини и топлинно обработената диета с високо съдържание на мазнини върху затлъстяването, атеросклерозата и състава на микробиотата в червата в цекума на апое -/- мишки.

Метод

Мъжки пол апое -/- мишките са били хранени или с диета с ниско съдържание на мазнини (LF), с диета с високо съдържание на мазнини (40 E% наситени мазнини, HF), или с диета с високо съдържание на мазнини (200 ° C за 10 минути, HT), в продължение на 8 седмици . Плазмените проби бяха използвани при анализа на Nε-карбокси-метил-лизин (CML) и Nε-карбокси-етил-лизин (CEL). Сърдечните проби бяха анализирани за атеросклеротични плаки и ДНК от цекума беше извлечена и анализирана за състав на микробиота, използвайки 16S rRNA генно секвениране на инструмент Miseq. Освен това функциите на микробните общности също бяха предсказани въз основа на бактериалната 16S rRNA генна последователност, използвайки Филогенетично изследване на общностите чрез реконструкция на ненаблюдавани състояния (PICRUSt).

Резултати

Тук открихме, че HT модифицира чревния микробиотен състав и затлъстяването на гостоприемника. Прогнозирането на бактериалните генни функции въз основа на 16S rRNA генна последователност разкрива, че HF увеличава бактериалните родове, обогатени с гени за липиден метаболизъм, докато HT не. Плазмените CML и CEL се увеличават съответно 1,7 и 2,5 пъти при мишки, хранени с НТ, в сравнение с мишки, хранени с HF. Въпреки по-ниската адипозия, мишките, хранени с НТ, поддържат атеросклероза и показват увеличени далаци.

Заключения

Резултатите предполагат, че топлинната обработка на диетата с високо съдържание на мазнини променя субстратите, достигащи до долната част на червата апое -/- мишки, което води до различни ефекти върху състава на микробиотата на червата. Изглежда AGE поддържат ефекта върху атеросклерозата, въпреки по-ниското затлъстяване и причиняват разширени далаци, които вероятно отразяват повишени нива на възпаление в тялото.

Заден план

Съвременната диета включва топлинна обработка на храната, което води до образуване на продукти на реакцията на Maillard (MRPs). Тези продукти са отговорни за аромата, цвета, вкуса и текстурата, както и за влошаването на хранителната стойност в преработената храна и неблагоприятните последици за здравето [1, 2]. Напоследък се обръща повече внимание на здравните последици от продуктите на реакцията на Maillard, особено тези, които водят до необратими модификации на аминокиселини, пептиди и протеини; крайни продукти за усъвършенствано гликиране (AGEs) [3–6]. Препоръчва се AGEs да бъдат свързани с маркери на риска за патологични състояния, медиирани от възпаление; като сърдечно-съдови заболявания, болест на Алцхаймер и свързани с диабет усложнения [5, 7–12]. Механизмът за индуцирана от AGEs токсичност може да бъде медииран чрез свързване с AGE рецептори (RAGE) и индуциране на провъзпалителна каскада [8, 13, 14] и съответно свързани патологични състояния. Образуването на кръстосани връзки, засягащо структурата на протеина, може също да повлияе на смилаемостта и по този начин модифицираните протеини могат да достигнат до долната част на червата, където могат да бъдат ферментирани от чревната микробиота [15].

Чревната микробиота е тясно свързана с множество аспекти на физиологията на гостоприемника. Общият баланс в състава на чревната микробиота е важен ключов фактор, осигуряващ нормалните функции на гостоприемника [16]. Няколко проучвания разкриха, че е установено, че наличието или отсъствието на чревна микробиота или някои специфични групи бактерии допринасят за развитието на много заболявания като диабет тип 2 [17, 18], артеросклероза [19, 20] и синдром на системния възпалителен отговор [21]. Известно е, че съставът на чревната микробиота се влияе от хранителните компоненти, достигащи долната част на червата. Досега ролята на индуцираното от процеса изменение на структурата на протеините върху смилаемостта и възможния метаболизъм от чревната микробиота е област, която е до голяма степен неизследвана.

Методи

Експериментален дизайн

Мъжки пол апое -/- мишки (Scanbur AB, Karlslunde, Дания), на 6-седмична възраст, бяха адаптирани към околната среда в животновъдния обект в продължение на 2 седмици преди започване на експеримента. На възраст от 8 седмици мишките бяха разделени на случаен принцип в три групи, съответстващи на теглото (н = 10, пет мишки/клетка). Мишките бяха хранени с диета с ниско съдържание на мазнини (LF), диета с високо съдържание на мазнини (HF) или диета с високо съдържание на мазнини (HT). Снимка на HF и HT е достъпна като допълнителен файл 1: Фигура S1. Мишките се претеглят всяка седмица. След 8 седмици мишките се анестезират с изофлуоран (Abbott Scandinavia AB, Solna, Швеция) и се прекратяват чрез сърдечна пункция. Претеглят се подложките на черния дроб, далака и епидидима. Кръвната плазма, сърцето и цекума бяха събрани и замразени при -40 ° C до по-нататъшни анализи. Плазмените проби бяха използвани при анализа на CML и CEL. Сърдечните проби бяха анализирани за атеросклеротични плаки и ДНК от цекума беше извлечена и анализирана за микробиота състав, използвайки 16S rRNA генно секвениране на инструмент Miseq.

Високопроизводителна течна хроматография, свързана с тандемна масспектрометрия за определяне на CML и CEL

Плазмени проби (50 μL) бяха хидролизирани в продължение на 12 часа при 110 ° C, използвайки 6 М HCl, заедно с изотоп, маркирани d4-CML и d4-CEL като вътрешен стандарт (Larodan Fine Chemicals AB, Malmö Швеция), и анализирани с помощта на високо налягане течна хроматография мас спектрометрия (HPLC-MS/MS). Хроматографското разделяне на CML и CEL в хидролизираните проби се извършва с помощта на помпа Accela UHPLC с автоинжектор. Откриването беше извършено с помощта на масспектрометър LTQ VelosPro Orbitrap (Thermo Scientific, Waltham, USA), работещ в режим на положителна електроспрей йонизационна йонна ловушка тандемна масспектрометрия (MS/MS), откриващ два прехода за селективен контрол (SRM) за всеки аналит и вътрешен стандартен. Софтуерът Xcalibur (Thermo Scientific) е използван както за събиране на данни, така и за оценка. Екстракция в твърда фаза, хроматографски параметри, параметър на източника на йони и SRM преходи са същите, както е описано в Tareke E. et al. [25].

Количествено определяне на атеросклероза

Замразени 10 μm участъци от аортния корен на сърцето бяха приготвени с помощта на криостат (Leica CM 1950, Leica Biosystems, Nusslock, Германия) и оцветени с Oil Red O (Histolab, Гьотеборг, Швеция) и хематоксилин (Mayer's HTX, Histolab, Гьотеборг, Швеция). Количеството атеросклеротични плаки, покриващи зоната на съда, е количествено определено от заслепен наблюдател, използвайки BioPixQ 2.0 (софтуер Biopix, Гьотеборг, Швеция). Бяха оценени три секции/мишка с добре ориентирани коренови области и всичките три налични клапи.

Състав на микробиотата на цекалите

Общо 22 цекални проби (LF (н = 4), HF (н = 8), HT (н = 9)) са използвани при анализа на микробиота. Цекалната тъкан и съдържанието се размразяват върху лед и ДНК се екстрахира с помощта на QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen), с добавяне на стъпка на биене на мъниста. Добавят се стерилни стъклени топчета (1 mm) в комбинация с буфер за лизис на изпражненията и се извършва разрушаване на клетките за 2 × 2 минути при 25 Hz с използване на TissueLyser (Qiagen), последвано от стъпка на нагряване при 95 ° С за 5 минути. След лизис, ДНК-увреждащи вещества и PCR инхибитори бяха отстранени с помощта на таблетка InhibitEX (доставена с комплекта) и ДНК беше пречистена на QIAamp Mini спин колони. Нормализирано въвеждане на 5 ng/μL от ДНК се използва при PCR реакции, където 16S rRNA гени са амплифицирани преди секвенирането.

Предсказване на бактериални метагеноми с помощта на PICRUSt

Бактериалните метагеноми бяха реконструирани на базата на бактериалната 16S rRNA генна последователност, използвайки софтуера с отворен код, PICRUSt [24]. Като вход се използва таблицата OTU, генерирана в QIIME от данните за секвениране 16S при 67 817 разредени последователности на проба. Броят на копията за OTU беше нормализиран преди метагеномът да бъде прогнозиран с помощта на базата данни на Киото енциклопедия на гени и геноми (KEGG) [29]. Резултатът от прогнозирането на метагенома беше анотирана таблица на прогнозирания брой генетични семейства за всяка проба, където генните фамилии бяха групирани по KEGG Orthology (KO) идентификатори.

статистически анализи

Еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) е използван за изчисляване на разликите в метаболитните маркери при различни групи мишки с помощта на Graphpad Prism 6. Разликите в богатството в рамките на общността (α-разнообразие) са изчислени в QIIME с помощта на непараметричен т-тест и P-стойностите бяха коригирани за множество сравнения, като се използва корекция на False Discovery Rate (FDR) [30]. Различията в състава на общността между групи от проби (β-разнообразие) бяха анализирани с помощта на непараметричен анализ на сходство (ANOSIM) [31] статистически тест в QIIME както на непретеглени, така и на претеглени филогенетични показатели на Unifrac. Graphpad Prism 6 също се използва за идентифициране на значителни разлики в таксономичните разпределения на нива на филум и род между групите мишки, използвайки двупосочен ANOVA и метода на Holm-Sidak за корекция за множество сравнения. Всички разлики се смятаха за значителни при P

Резултати

Биомаркери

Като се има предвид, че няма разлика в консумацията на храна на мишките в различни групи (фиг. 1а), мишките, хранени с HF, имат значително по-високо телесно тегло в крайната точка в сравнение с мишките, хранени с LF (P Фиг. 1

термично

Индекси на микробното разнообразие

Оценката на α-разнообразие на бактериален 16S rRNA ген при пореден номер от 67 817 последователности/проба (Фиг. 2а) демонстрира, че HF има тенденция към намалено α-разнообразие в сравнение с LF. Освен това HT понижава α-разнообразието още повече, тъй като наблюдаваните OTU и индексите на цялото дърво на филогенетичното разнообразие (PD цялото дърво) показват значителни разлики между HT и LF (P Фиг. 2

Индекси и разпределение на разнообразието на нива на тип и род на чревната микробиота при мишки, хранени с LF, HF и HT. а Алфа крива на разреждане (PD на цялото дърво), показваща разлики в богатството в общността (α-разнообразие). б Непретеглено и ° С Претеглени UniFrac PCoA парцели, показващи разлики в състава на общността между групи мишки (β-разнообразие). д Относително изобилие на чревната микробиота при филума. д Относително изобилие на най-многобройните родове (> 5% относително изобилие). Отчитанията се нормализират до 67 817 последователности/проба

Таксономични разпределения на ниво филум

Относителното изобилие на ниво филум (фиг. 2г) разкрива, че е установено, че Firmicutes е най-доминиращият тип във всички групи и е последван от Bacteroidetes. Нивото на Firmicutes е значително по-високо в HT от LF и HF (и двете P Фиг. 3

Графика на LDA за бактериални таксони (а) и гени (б) с резултати от LDA по-високи от 2. Бактериалните таксони и гените, обогатени с LF, са жълт, HF в син и HT в червен

Предсказване на функционалната структура на гените въз основа на 16S генна информация, използвайки PICRUSt

Освен това, гени, обогатени с LF, са включени в генетичната информация, особено за репликация и възстановяване на хромозома, биогенеза на рибозома и некласифициран транслационен протеин. Ген, обогатен с HF, участва в клетъчните процеси, особено за клетъчен растеж и смърт, а ген, обогатен с НТ, участва в некласифицирана функция (Фиг. 3b).

Чревна микробиота и метаболитни биомаркери

Натоварване и разсейване на резултатите (фиг. 4) PLS графики илюстрират асоциации между чревната микробиота и различни биомаркери, както и разкриват отделни клъстери на мишките чрез различни обработки (фиг. 4, малък панел). Резултатите подкрепиха резултатите на LEfSe (Фиг. 3а и Допълнителен файл 2: Фигура S2), където тези бактерии, обогатени в различни групи лечение, бяха разположени в съответната област на PLS участъка (Фиг. 4). Sutterella, Anaeroplasma, Adlercreutzia и Лактобацилус за които е установено, че са обогатени с LF, са разположени в долния компонент на PLS парцела. Муциспирилум и Лактококи обогатени с HF бяха разположени в горния десен компонент, докато Алобакулум се намира в горния ляв компонент на PLS парцела. Анализирани са и корелациите между чревната микробиота и различните биомаркери. Установено е, че относителното тегло на далака е положително корелирано с Дехалобактериум (P Фиг. 4

Зареждане (голям панел) и разпръскване на резултатите (малък панел) PLS парцели, показващи корелация между чревната микробиота и различни биомаркери. Родовете на бактериите са показани в малки кръгове и оцветени от вида, към който принадлежат (зелено, Актинобактерии; тъмно синьо, Бактероидети; червен, Цианобактерии; жълт, Deferribacteres; светло синьо, Фиксира, лилаво, Протеобактерии; оранжево, Тенерикути; розово, Verrucomicrobia). Метаболитните биомаркери са показани в черни звезди. Всеки кръг в графика за разпръскване на резултатите (малък панел) представлява всяка мишка и е оцветен от групата, към която принадлежат (жълт, LF; син, HF; червен, HT)

Дискусия

Заключения

В заключение, приемът на диета с високо съдържание на мазнини доведе до повишено затлъстяване, намалено разнообразие на микробиотата и променен състав на микробиотата в червата. Химическите модификации на диетата с високо съдържание на мазнини чрез топлинна обработка изглежда намаляват субстратите, достъпни за членовете на чревната микробиота, които имат гени за липиден метаболизъм, което води до по-ниско затлъстяване. Въпреки това, общите промени в чревната микробиота все още са спрямо тези, свързани с рискови фактори на затлъстяването. Освен това AGEs, образувани в HT, могат да бъдат възможна причина за разширяване на далака, което вероятно отразява повишени нива на възпаление в тялото. По-ниският прием на топлинно обработена храна може да се наложи да се вземе предвид при разработването на диетичен превантивен подход на метаболитния синдром.

Етично одобрение

Изследването е одобрено от местната комисия за етичен преглед на експерименти с животни в Лунд, Швеция (номер на одобрение M-295-12).