Резюме

Изолиране на мастните клетки и определяне на размера и броя на мастните клетки.

Едно парче, ~ 300 mg, се замразява в течен азот и се съхранява при -70 ° C за последващ Western blot анализ. Бяха подготвени изолирани мастни клетки, както е описано от Rodbell (21). Извършено е директно микроскопско определяне на диаметъра на мастните клетки, както е описано по-горе (20). Средният обем и тегло на мастните клетки се определят, както е описано по-рано (22). Общото съдържание на липиди в аликвотната маса се определя гравиметрично след органична екстракция и броят на мастните клетки може да се изчисли чрез разделяне на общото тегло на липидите на средното клетъчно тегло. Този метод дава същите резултати като директния метод за определяне на броя на клетките (23,24).

уникален

Експерименти с липолиза.

Изолираните мастни клетки се инкубират, както е описано подробно по-рано (11–15). Накратко, разредената суспензия на мастните клетки се инкубира в два екземпляра в продължение на 2 часа с или без увеличаване на концентрациите на норепинефрин, неселективния β-адренергичен агонист изопреналин, селективния β1-адренорецепторен агонист добутамин, селективния β2-адренорецепторен агонист тербуталин, селективния частичен β3-адренорецепторен агонист CGP 12177, устойчив на фосфодиестераза cAMP аналог дибутирил cAMP (dcAMP), селективен агонист на α2-адренорецептор UK 14304, фенилизопропил аденозин (неметаболизиращ аналог на аденозин), простагландин Е2, простагландин Е2, Всички инкубации се извършват при 37 ° C в фосфатен буфер Krebs-Henseleit (pH 7,4), допълнен с глюкоза (1 g/l), BSA (20 g/l) и аскорбинова киселина (0,1 g/l) и в антилиполитични експерименти, аденозин дезаминаза (1 mU/ml), както и 10-3 mmol/l 8-бромоцикличен AMP (8bcAMP), с въздух като газова фаза. След инкубация бе отстранена безклетъчна аликвота за определяне на глицерол, което е индекс на липолиза.

Концентрацията (log mol/l) на агонист, причиняващ половин максимален ефект (EC50), беше определена, използвайки логистично преобразуване на всяка крива на реакция на концентрация. Максималният ефект (отзивчивост) на всеки агонист се определя като освобождаване на глицерол при максимална ефективна концентрация на агонист.

Протеинова изолация и Western blot анализ.

HSL антитела.

Човешкият HSL съществува в две форми поради алтернативно снаждане на екзон 6 (25). Те обикновено се наричат ​​HSL-long и -short. В настоящото проучване използвахме антитяло, което е специфично за дългия вариант и друго, което разпознава и двете форми. HSL-дългото антитяло се генерира при зайци, както беше описано по-рано (25). 15-остатъчен синтетичен пептид (QPAASPSRLLSLMDBP), получен от аминокиселинната последователност, кодирана от екзон 6, беше свързан към хемоцианин на отвора на лимфен отвор чрез добавен COOH-краен остатък от цистеин и беше използван за имунизиране на зайците. Показано е, че антисерумът разпознава специфично човешки HSL с пълна дължина (HSL-long), докато не разпознава варианта на снаждане, в който липсва екзон 6 (HSL-къс). Антитела, разпознаващи HSL-long и -short, се генерират в пилето, както е описано по-рано (26,27). Накратко, имунизираният пилешки антисерум беше пречистен по афинитет срещу рекомбинантен HSL на плъх, свързан с CNBr-активираща сефароза 4В колона (Amersham Pharmacia Biotech, Упсала, Швеция). Показано е, че афинитетно пречистените антитела са специфични за двете форми на HSL.

Наркотици и химикали.

BSA (фракция V, A4503), Clostridium histolyticum колагеназа тип 1, глицерол киназа от Escherichia coli (C-0130), форсколин (Calbiochem 344270; Calbiochem, La Jolla, CA) и норепинефрин [(-) - Arterenol A-9512] dcAMP са получени от Sigma Chemical (Сейнт Луис, МО). Аденозин дезаминазата ADA е от телешки черва и се доставя от Roche Diagnostics Scandinavia (Bromma, Швеция). Добутамин хидрохлорид е закупен от Eli Lilly (Индианаполис, IN), а тербуталин сулфат е получен от Astra (Lund, Швеция). CGP (±) 12177 [(-) - 4- (3-t-бутиламино-2-хидрокси-пропокси) -бензимидазол-2-он] е от Ciba Geigy (Базел), а UK 14304 тартарат е от Pfizer (Sandwich, Великобритания). Реагентът за мониторинг на АТФ, съдържащ луцифераза на светулка, идва от Biothema (Стокхолм). Всички други химикали са с най-висок клас на чистота, наличен в търговската мрежа.

Статистика.

Двустранният t тест на Student беше използван за сравнение на данни между (несдвоени) и в (сдвоени) групи. Данните също бяха анализирани от ANOVA, като се вземе предвид възрастта или обема на мастните клетки чрез ковариационен анализ и концентрация на лекарството чрез повторен анализ на измерването. SD беше използван като мярка за разпръскване на данните за клиничните характеристики (Таблица 1), а SE беше използван за експериментални данни, когато е нормално разпределен. Извършен е и линеен регресионен анализ. Всички статистически изчисления са извършени със статистически софтуерен пакет (Statistica; StatSoft, Tulsa, OK).

РЕЗУЛТАТИ

Клинични характеристики.

Клиничните данни са показани в Таблица 1. Жените с СПКЯ са имали леко, но значително (P = 0,03) намаление на Kitt, което показва някои in vivo инсулинова резистентност. Те обаче не показаха други характеристики на синдрома на инсулинова резистентност, тъй като WHR, плазмените нива на гладно на инсулин, глюкоза, триглицериди и холестерол, както и ИТМ, бяха сравними с тези на контролните жени. Няма разлика между пациентите с СПКЯ и контролните субекти по отношение на изчислената подкожна и висцерална мастна тъкан, независимо дали общата площ или делът на различните мастни депа е определен чрез CT на нивата L3 и L4 (стойностите не са показани за L4 ). По същия начин няма разлика в теглото на мастните клетки между групите. Въпреки това, жените с СПКЯ са били средно с 4 години по-млади от контролните жени (P = 0,01). Кръвното налягане е било нормално и в двете групи (стойностите не са показани). Както се очаква от измерванията на половите хормони и свързващите протеини, жените при СПКЯ са имали хиперандрогенемия.

Експеримент с липолиза.

Кривите на средната концентрация на реакция за индуцирана от агонист липолиза са показани на фиг. 1–3. Стимулирането на липолизата с норепинефрин или β1-, β2- и β3-адренорецепторни селективни агонисти е много по-ефективно при СПКЯ, отколкото при контролните субекти. Това важи и за стимулация на ниво аденилил циклаза с форсколин или на ниво РКА с dcAMP. Всички средни криви за стимулиращи липолиза агенти се различават значително (P от 0,02 до 0,04), когато се сравняват PCOS и контролното състояние. Въпреки това, инхибирането на липолизата на нивото на инсулиновия рецептор, α2-адренорецептор, както и на аденозиновия рецептор и простагландиновия рецептор, е сходно и в двете групи.

Анализът на липолизата от индивидуалните криви на реакция на концентрация е показан в Таблица 2. Няма разлика в скоростта на основната липолиза, както и в липолитичната чувствителност на който и да е от използваните агонисти (отрицателен логаритъм на EC50) в мазнината между двете групи. Отзивчивостта (липолитична скорост при максимално ефективна концентрация) на норепинефрин, на селективните и неселективни β-адренорецепторни агенти и на всички пост-адренорецепторни агенти се повишава с ∼50% при СПКЯ, което е статистически значимо за всички агенти с изключение на dcAMP (Р = 0,056). Отзивчивостта на всички антилиполитични агенти обаче е сходна в двете групи. Използвана е само една концентрация на лекарството (1 mmol/l) за 8bcAMP. Няма значима корелация между инсулиновата чувствителност (Kitt варира между 3,2 и 6,5 за всички пациенти) и липолитичната реакция за всеки агент (r 2, n = 34). Използва се изопреналин, тъй като максимално активира липолизата. Използвайки линеен регресионен анализ, не се наблюдава значително влияние на възрастта върху базалната (r = 0,29) или максималната изопреналин (r = 0,08) -индуцирана липолиза.

Протеинова изолация и Western blot анализ.

Нашите резултати показват, че повишената липолитична активност при пациенти със СПКЯ се дължи на ефект на ниво PKA-HSL. Това ни подтикна да изследваме възможни промени в липолитичната сигнална каскада чрез изучаване на протеиновата експресия на различни компоненти в комплекса PKA, както и HSL. Комплексът РКА присъства като хетеротетрамер, съставен от две каталитични и две регулаторни субединици. Последните се подразделят на два класа (I и II), които от своя страна присъстват в две различни изоформи (α и β). Предишни проучвания показват, че двете основни регулаторни субединици, изразени в мастните клетки, са изоформите RIα и RIIβ (28), а промените в относителната експресия на субединицата могат да доведат до променена вътреклетъчна сигнализация при животински модели (29,30,31). HSL е преобладаващата липаза, експресирана в мастната тъкан (32). При хората се получава специфично снаждане на екзон 6, което води до експресията на две форми на HSL. Единият е протеин с пълна дължина с пълна биологична активност (HSL-long), а другият е пресечен вариант, който е лишен от всякаква липазна и естеразна активност (HSL-short) (25).

ДИСКУСИЯ

В това проучване изследвахме липолиза на висцералната мастна тъкан при СПКЯ. Това е от значение за диабет тип 2, първо, поради предполагаемата роля на висцералните мастни киселини за много аномалии, наблюдавани при така наречения синдром на инсулинова резистентност (метаболитен) и, второ, поради силното сходство между СПКЯ и метаболитния синдром . За да се разграничат първичните и вторичните промени в липолизата, ние изследвахме немобилни, млади и здрави PCOS жени. Тези жени не са показали клинични аномалии в състава на телесните мазнини, липидния профил или циркулиращия инсулин, но вече имат лека цялостна ин виво инсулинова резистентност, както се оценява от интравенозния инсулинов толеранс. Признаваме, че това е груба мярка за инсулинова чувствителност in vivo, но показва силна корелация с по-сложния метод на евгликемично-хиперинсулинемична скоба (18). Вероятно поради подбора на двете проучвани групи, PCOS жените са малко по-млади (средно 4 години) от контролните жени. Този малък период на възрастта обаче няма важно значение за резултатите, както се оценява от настоящите разследвания за влиянието на възрастта върху липолизата. Освен това последните данни показват подобна регулация на липолизата при по-млади и възрастни жени (33).

От проучвания върху HSL става ясно, че липолизата в мастните клетки може да се активира от алтернативни и все още не дефинирани липази (32). Тези липази могат също да участват в повишената липолитична реакция на висцералните мастни клетки при PCOS.

Има някои скорошни доказателства за ролята на висцералната мастна тъкан за функцията на черния дроб. Селективното отстраняване на висцералната мазнина подобрява функцията на черния дроб при гризачи (40). Премахването на основния салник във връзка с бариатрична хирургия при затлъстяване подобрява инсулиновата чувствителност, хиперинсулинемията и непоносимостта към глюкоза независимо от намаляването на телесното тегло (41).

Видна черта на СПКЯ е хиперандрогенемията, която също е установена в настоящото проучване. Изследвания върху адипоцити на плъхове предполагат, че тестостеронът подобрява липолизата, стимулирана от катехоламин, поради множество промени в трансдукцията на сигнали, включващи PKA-HSL (42,43). Не е вероятно обаче повишената промяна на липолизата при СПКЯ да е вторично явление поради високите нива на андроген. Пероралното контрацептивно лечение, което нормализира нивата на андроген, не подобрява индуцираната от катехоламин липолиза в подкожната мастна тъкан на слаби (14) или затлъстели жени при СПКЯ (15). Селективното регулиране на липолизата във висцералната мазнина от андрогени изглежда по-малко вероятно, тъй като тестостероновите рецептори присъстват в подкожните и висцералните мастни депа, въпреки че те са по-разпространени във висцералната област (44).