Резюме

Предназначение

Целта на това проучване беше да се изследват ефектите от високия прием на протеини от майката върху оста на чернодробния растеж при потомството.

Методи

Четиринадесет първородни чистопородни свине майшани бяха хранени със стандартен протеин (SP, н = 7) диета или високо протеинин (HP, 150% от SP, н = 7) диета по време на бременност. Потомство (по един мъж и жена), н = 14) на ден 70 от ембрионалния стадий и на дни 1, 35 и 180 след раждането са избрани, претеглени и убити. Серумните проби бяха анализирани за нива на Tch, инсулин и инсулиноподобен растежен фактор, свързващ протеин 3 (IGFBP-3). Анализирани са чернодробни проби IGFBP-3 и IGF-Аз експресия на иРНК чрез qRT-PCR и за IGFBP-3, IGF1R и експресия на протеин на рецептор на растежен хормон (GHR) чрез Western blotting. Основният механизъм на регулиране на IGFBP-3 е определен чрез метилирана ДНК имунопреципитация (MeDIP) и хроматин имунопреципитация (ChIP).

Резултати

Експозицията с високо съдържание на протеини води до значително по-високо телесно и чернодробно тегло на прасенца и увеличава серумните нива на Т3 и Т4 при раждането и/или при отбиването. Освен това, съдържанието на IGFBP-3 протеин в черния дроб и серума е значително намалено при изложени на HP отбиващи прасенца, докато на ниво транскрипция IGFBP-3 експресията на иРНК беше понижена в черния дроб на прасенца от групата на НР. И накрая, бяха наблюдавани ДНК хиперметилиране и по-високо обогатяване на хистоновите репресивни марки H3K27me3 и H3K9me3.

Заключения

Взети заедно, тези резултати предполагат, че високо протеиновата диета при майката по време на бременността епигенетично препрограмира IGFBP-3 генна експресия за модулиране на оста на чернодробния растеж при отбитите прасенца.

Въведение

Интересното е, че е добре документирано, че епигенетичната регулация променя феталната експресия на гени по време на програмирането на майчиното хранене. Например при изследване на рака генът IGFBP-3 е описан като уязвим към епигенетична регулация, включително метилиране на ДНК и модификация на хистон [26]. Струва си да се спомене, че IGFBP-3 може да блокира свързването на IGF-I и IGF-II с техните рецептори и следователно играе важна роля в стимулирането на клетъчната пролиферация. Въпреки това дали диетичната намеса на майката влияе върху генната експресия при потомството чрез епигенетика не е добре проучена. Nawathe и сътр. показа, че метилирането на ДНК участва в промени в генната експресия в оста на IGF при нарушения на растежа на плода [27], докато недохранването на майките променя транскрипцията на метаболитни гени в черния дроб чрез ДНК метилиране и модификацията на хистони, включително H3K4me3, H3K27me3 и H3K9me1 [28, 29 ]. Освен това се установява, че модификации на H3K14ac и H3K9me3 се наблюдават в метаболизма на липидите на черния дроб на плода, когато са изложени на диета с високо съдържание на мазнини вътреутробно [30].

Интригуващо е, че гените, участващи в чернодробния клетъчен цикъл и растежа при новородени прасенца, се регулират чрез модифициране на хистона, когато язовирите са изложени на хранителни добавки с донори на метил [31]. Въз основа на тези проучвания, ние предположихме, че епигенетичните събития по време на програмирането на майчиното хранене могат да играят решаваща роля за модифициране на оста на растеж на IGF-I/IGFBP-3 на черния дроб при потомството.

Meishan (MS), китайска коренна порода свине, свинете са използвани в настоящото проучване като животински модел за очертаване на въздействието на високо протеинова диета при майките върху оста на черния дроб на IGF на потомството прасенца на различни етапи от живота. Взети са проби от кръв и черен дроб от свине майки в 70-дневна бременност, от прасенца при раждане, от отбити прасенца на 35 дни и от угоени прасета на 180 дни. Ние имахме за цел да изследваме възможните епигенетични механизми за регулиране на специфични гени, участващи в IGF-I/IGFBP-3 пътя в черния дроб.

Методи

Животни и вземане на проби

Експерименталният протокол беше одобрен от Комитета по етика на животните от Северозападния университет A&F. Всички процедури са в съответствие с „Насоките за етично отношение към опитни животни“ (2006) № 398, определени от Министерството на науката и технологиите, Китай. Осемнадесет първородни чистокръвни мейшански младозоби са получени от Националната ферма за опазване и отглеждане на свине Мейшан в Политехническия колеж по селско и горско стопанство Дзянсу, Джуронг, провинция Дзянсу, П. Р. Китай. Те бяха разпределени на случаен принцип в група с високо протеиново (HP) или стандартно протеиново (SP).

Свинете са хранени с диети, съдържащи или 14% суров протеин в групата на HP, или 7% суров протеин в групата на SP (Таблица 1). Диетичното лечение започва от първото наблюдение на еструса и изкуственото осеменяване се извършва при второто еструс. За изкуствено осеменяване е използвана смес от проби от сперма, получени от две нересла, и скоростта на оплождане не е повлияна от диетичното лечение на майката. Свинете са хранени два пъти дневно (0800 и 1400 h) с дажби от 1,8 kg/ден по време на бременността. Както е показано на фиг. 1, ние произволно избрахме прасенца на 70-ия ден от ембрионалния стадий (E70) и на 1-ви (D1), 35-и (D35) и 180-и (D180) дни. На всеки етап по един мъж (н = 7) и една жена (н = 7) прасенце (на експериментална група) със средно телесно тегло ± 10% бяха избрани от всяко котило и убити. Събира се кръв, последвано от незабавна серумна подготовка и пробите от черния дроб (без жлъчния мехур) се замразяват незабавно в течен азот и се съхраняват при - 80 ° C за допълнителен анализ.

високопротеиновата

Експериментален дизайн. По време на бременност на майките се хранеха стандартни протеинови (SP) или високопротеинови (HP) диети. Потомците на различни диетични групи бяха анализирани на ембрионален ден 70 (E70) и ден след раждането 1 (D1), ден 35 (D35) и ден 180 (D180). SP стандартен протеин по време на бременност и кърмене, HP високобелтъчна диета по време на бременност и кърмене

Tch, инсулин и IGFBP-3 в серум

Измервани са серумни концентрации на инсулин (F01PZB), T3 (A01PZB) и T4 (A02PZB), като се използват специфични търговски комплекти RIA (Пекинския Северен институт по биологична технология) с чувствителност на анализа от 5 μIU/L, 0,25 mg/L и 5 mg/L, съответно. Вариациите в интра- и между теста са 10% или 15% за използвания комплект. Нивата на серумен IGFBP-3 бяха измерени с помощта на търговски комплект ELISA (Abcam, ab100541), следвайки инструкциите на производителя.

Общо изолиране на РНК и количествено определяне на иРНК

Обща РНК беше изолирана от чернодробни проби, използвайки реагент TRIzol (Tiangen Biotech Co., Ltd., Пекин, Китай). IScript cDNA Synthesis Kit (Promega, Madison, WI, USA) беше използван за синтезиране на cDNA от 2 μg обща РНК от всяка проба, съгласно инструкциите на производителя. Два микролитра разредена cDNA (1:50) бяха използвани за количествена PCR в реално време. Последователностите на праймерите са показани в Таблица 2 и са синтезирани от Invitrogen (Шанхай, Китай). PCR в реално време се извършва с Mx3000P (Stratagene, САЩ). Техническите вариации бяха нормализирани към GAPDH като вътрешен контрол. Специфичността на амплификацията се определя чрез анализ на кривата на топене и PCR секвениране на продукта.

Екстракция на тъканни протеини и Western blot анализ

Общо клетъчен протеин и ядрен протеин бяха извлечени от 100 mg замразена чернодробна тъкан, както е описано по-горе [32, 33]. Концентрацията на протеин беше измерена с Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, САЩ). Western blot анализ за IGF-1R (ab226871, Abcam, UK, разреден 1: 100), IGFBP-3 (ab231034, Abcam, UK, разреден 1: 100) и GHR (ab202964, Abcam, UK, разреден 1: 200) беше извършено съгласно препоръчаните протоколи, предоставени от производителя.

Метилирана ДНК имунопреципитация (MeDIP)

Анализът на метилирана ДНК имунопреципитация (MeDIP) беше извършен, както беше описано по-рано с някои модификации [12]. Накратко, геномната ДНК на черния дроб се обработва с ултразвук и се денатурира с топлина, за да се генерира едноверижна ДНК. Моноклонално антитяло на мишка срещу 5-метил цитозин (ab10805, Abcam) беше използвано за имунно утаяване на метилирани ДНК сегменти. Предварително обработени G-протеинови агарозни зърна (40 μL, 50% суспензия, sc-2003, Santa Cruz Biotechnology) са използвани за улавяне на утаените имунни комплекси, а пречистена MeDIP ДНК е използвана за усилване на проксималните промоторни последователности на целевите гени чрез RT-PCR . Островите CpG на организатора на IGFBP-3 генът беше оценен чрез Methyl Primer Express v1.0 (Applied Biosystems, USA), като се използват следните критерии:% GC> 50%, дължина> 200 bp и наблюдавано CpG/очаквано CpG> 0.6. Чифт отрицателни контролни праймери бяха използвани за усилване на промоторен регион без CpG места като вътрешен контрол и резултатите от MeDIP бяха изчислени спрямо вътрешния контрол. Конкретните грундове са показани в Таблица 2.

Хроматин имунопреципитация (ChIP)

Статистически анализ

Всички данни са представени като средната стойност ± S.E.M. и бяха анализирани с помощта на независими проби т тест със SPSS 22.0. Методът 2 - ΔΔCt беше използван за анализ на RT-PCR данните, изразени като промяна в гънките спрямо групата SP. Тъй като нито един от откритите параметри не показва неравенства между половете, мъжете и жените бяха групирани заедно, в резултат на което н = 14 във всяка група. Броят на прасенцата за различните измервания постигна статистическа мощност от 0,95 (използвайки т тест) между групите, със съответните стандартни грешки. Разликите бяха счетени за значителни при стр

Резултати

Високопротеиновата диета при майките увеличава телесното и чернодробното тегло на прасенцата и променя серумните параметри

Както е показано в таблица 3, прасенца, получени от свине, хранени с диети, са показали значително по-високо телесно теглостр Таблица 3 Телесно тегло, чернодробно тегло и чернодробен индекс на потомството прасенца в ембрионални 70 (E70), постнатални 1 (D1), 35 (D35) и 180 (D180) дни

Високопротеинова диета при майките намалява съдържанието на IGFBP-3 в черния дроб и нивото на IGFBP-3 в серума при отбитите прасенца

За да идентифицираме възможните събития, които са причинили растежните ефекти при прасенца, извършихме Western blot за откриване на ключовите протеини, участващи в оста на растежа на черния дроб. Съдържанието на протеин IGF-1R беше значително повишено при раждането, докато съдържанието на протеин IGFBP-3 бе значително намалено при отбиване при прасенцата, изложени на HP (фиг. 3а – в). Съдържанието на GHR протеин е непроменено във всеки един от тези моменти от живота на потомството (фиг. 3а и г). Освен това, в съответствие с намаленото съдържание на протеин IGFBP-3, ние разкрихме, че нивото на серумен IGFBP-3 също е било намалено при изложени на НР прасенца, отбити, както и при възрастни потомци (фиг. 4).

Високопротеиновата диета при майките регулира чернодробната IGFBP-3 транскрипция

Като се имат предвид значителните промени в съдържанието на чернодробни протеини в IGF-1R и IGFBP-3 при прасенца, изложени на HP, е проведена qRT-PCR, за да се потвърди нивото на транскрипция на тези два гена. IGFBP-3 mRNA беше значително понижена в черния дроб на отбитите и възрастни прасенца в резултат на лечение с HP (Фиг. 5а). За разлика, IGF-Аз генната експресия на ниво транскрипция при прасенца не е била повлияна от лечението по всяко време (фиг. 5б).

Епигенетична регулация на гена IGFBP-3 при изложени на HP прасенца за отбиване

За да се определят основните механизми, участващи в регулирането надолу IGFBP-3 генна експресия при изложени на HP прасенца за отбиване, MeDIP и ChIP-qPCR са извършени за измерване на метилиращия статус на промоторния регион IGFBP-3 ген. В съответствие с промяната в нивото на транскрипта, ДНК хиперметилиране на IGFBP-3 ген (Фиг. 6). В допълнение, репресивните хистонови марки H3K27me3 и H3K9me3 бяха по-силно обогатени с промотора IGFBP-3 в черния дроб на отбитите прасенца (фиг. 7а, б). Забележително е, че обогатяването на свързването на активния хистонов знак H3K4me3 също е намалено, когато се нормализира до H3. Въпреки че ацетилирането на хистона е от решаващо значение за регулиране на генната експресия, H3AC не се променя значително в отговор на експозицията на HP.

Дискусия

От друга страна, общоприето е, че лошият фетален растеж е свързан с ускоряване на постнаталния растеж като компенсаторен отговор и е свързан с повишен риск от метаболитни нарушения в дългосрочен план [43, 44]. Ранното забавяне на растежа и по-късният компенсаторен растеж също са наблюдавани след отбиването и в зряла възраст [44, 45]. В тази връзка, намалената експресия на IGFBP-3, препрограмирана от високо диетичен протеин на майката, може да бъде реакция на адаптация за забавяне на растежа от отбиването до живота на възрастните. Струва си да се спомене, че IGFBP-3 генът, но не и съдържанието на протеин, все още беше регулирано до зряла възраст в нашето проучване. Това предполага, че може да се включи регулиране след транскрипция. Една от възможностите е, че микроРНК са насочени към разграждане на иРНК и/или транслационна репресия. Многобройни проучвания съобщават, че хранителните добавки при майките регулират генния транслация чрез модифициране на микроРНК функцията [31, 46]. Дали обаче дисоциацията на намаленото IGFBP3 експресията на мРНК и непроменената експресия на протеин IGFBP-3 в черния дроб на прасенца се индуцира от пост-транскрипционен механизъм, който е извън фокуса на настоящото проучване и може да оправдае бъдещи изследвания.

Следродилният етап, особено периодът на отбиване, е от решаващо значение за растежа на животните и за здравето в зрелия живот [47, 48]. Въз основа на нашите данни и данни от други проучвания, програмирането на майчиното хранене модулира растежа и функцията на черния дроб при потомството предимно чрез епигенетична регулация [33, 49, 50]. Интригуващо демонстрирахме, че пониженото ниво на иРНК на IGFBP-3 в черния дроб е свързано със съдържанието на протеин. Изследванията на рака показват доказателства, че IGFBP-3 генът е уязвим към епигенетична регулация, включително метилиране на ДНК и модификация на хистон [26]. Разбирането на майчиното потомство обаче IGFBP-3 регулирането на генната експресия е ограничено. В подкрепа на схващането, че метилирането на ДНК функционира върху оста IGF във феталния растеж [27], нашите данни разкриват, че метилирането на CpG е засилено върху промотора на IGFBP-3 при прасенца от HP при отбиването, като по този начин блокира намаляването на транскрипцията IGFBP-3 експресия на иРНК.

В заключение, нашето проучване разкрива, че високопротеинова диета при майките, дадена по време на бременността, модулира оста на чернодробния растеж при отбитите прасенца. Това може поне отчасти да се дължи на препрограмирането на функцията IGFBP-3 чрез метилиране на ДНК и модификация на хистон. Нашите открития за епигенетична регулация на IGFBP-3-медиирана ос за растеж на черния дроб, участващи в програмирането на майчиното хранене, предоставят основен механизъм за това как диетичният протеин модулира феталния растеж. Като се има предвид, че отбиването е критичен период от живота, здравословният модел на растеж, изграден от ранния живот, може да намали риска от развитие на затлъстяване в зряла възраст.