Liqing Zang

1 Висше училище за регионални иновационни изследвания, Университет Ми, Цу, Ми 514-8507, Япония

анализ

2 Mie University Zebrafish Drug Screening Center, Tsu, Mie 514-8507, Япония

Ясухито Шимада

2 Mie University Zebrafish Drug Screening Center, Tsu, Mie 514-8507, Япония

3 Катедра по интегративна фармакология, Медицински факултет на Университета Ми, Цу, Мие 514-8507, Япония

4 Катедра по биоинформатика, Mie University Science Science Research Center, Tsu, Mie 514-8507, Япония

Хироко Накаяма

1 Висше училище за регионални иновационни изследвания, Университет Ми, Цу, Ми 514-8507, Япония

2 Mie University Zebrafish Drug Screening Center, Tsu, Mie 514-8507, Япония

Youngil Kim

5 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd., Осака 544-8666, Япония

Джонг-Чи Чу

5 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd., Осака 544-8666, Япония

Лех Радж Джунджа

5 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd., Осака 544-8666, Япония

Джуня Куроянаги

6 UMOU Science Lab, Mastusaka, Mie 515-0303, Япония

Норихиро Нишимура

1 Висше училище за регионални иновационни изследвания, Университет Ми, Цу, Ми 514-8507, Япония

2 Mie University Zebrafish Drug Screening Center, Tsu, Mie 514-8507, Япония

Свързани данни

Резюме

1. Въведение

Рибата зебра е добре характеризиран модел на гръбначни животни за биология на развитието, откриване на лекарства, токсикология, човешка генетика и изследвания на човешки заболявания [17,18,19]. Той демонстрира голямо сходство с човешкия геном и с човешката анатомия и физиология. Напоследък проучванията върху рибите зебра са фокусирани върху неговите предимства, свързани с изследванията на метаболитния синдром, включително затлъстяване и захарен диабет тип 2 [20]. Оптично полупрозрачното тяло предоставя уникална възможност да се наблюдава затлъстяване на целия организъм в ларвата на риба зебра чрез нилско червено или маслено червено O оцветяване [21,22]. Доказано е сходството на липидния метаболизъм и адипогенезата при ребрата зебра с бозайниците [23]. Възрастните рибки зебра също са отличен модел за провеждане на изследвания за затлъстяване [24]. Прекомерното хранене, предизвикано от затлъстяване при риба зебра показва симптоми, подобни на тези при хората, като хипертриглицеридемия и хепатостеатоза, и споделя общи патофизиологични пътища на затлъстяване при бозайници [24]. Като цяло рибите данио представляват привлекателен модел, който да се използва за оценка на ефекта от функционалните храни и съединения върху развитието на затлъстяването и лечението му [25,26,27].

В това проучване ние администрирахме екстракт от зелен чай (GTE) както за модели на затлъстяване на ларви, така и за възрастни данио, за да оценим ефекта на GTE срещу затлъстяването. По-нататък извършихме РНК секвениране (RNA-seq) на чернодробни тъкани от възрастни рибки зебра, за да изследваме основния молекулен механизъм на GTE и да сравним профилите на генната експресия с тези на бозайници, като изследвахме мишки като модел.

2. Резултати

2.1. GTE намален обем на висцералната мастна тъкан (ДДС), предизвикан от диета с високо съдържание на мазнини в ларви на зебра

В това проучване демонстрирахме, че GTE значително потиска натрупването на висцерална мастна тъкан в ларвите на данио и подобрява фенотипите на затлъстяването при възрастни зебра, включително висцерално затлъстяване и дислипидемия. Анализът на пътя на RNA-seq данни разкрива, че GTE може да потисне натрупването на липиди чрез активиране на сигналните пътища WNT/β-катенин и AMPK. Сравнителен анализ на транскриптома, използващ чернодробни тъкани, третирани с GTE, разкрива, че рибите зебра и бозайниците (изследвани с помощта на миши модел) споделят общи молекулярни пътища.

4. Материали и методи

4.1. Декларация за етика

Всички процедури за животни бяха одобрени от Комитета по етика на Университета Ми, бяха извършени в съответствие с японския закон за хуманно отношение към животните относно „Благосъстоянието и управлението на животните“ (Министерство на околната среда на Япония) и в съответствие с международните насоки.

4.2. Щамове и поддръжка на Zebrafish

Zebrafish (щам AB; Международният изследователски център Zebrafish, Eugene, OR, USA) се отглежда и поддържа при стандартни лабораторни условия при 28 ° C с цикъл светлина/тъмнина 14/10 h [44]. Ембрионите се събират след оплождане и се съхраняват при 28 ° С в 0.3X разтвор на Danieau (17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgSO4, 0.18 mM Ca (NO3) 2 и 1.5 mM 4- (2-хидроксиетил) -1- пиперазинил-етан-2-сулфонова киселина (HEPES); рН 7,6). Рибите са били хранени с GEMMA Micro 75–300 (Skretting, Fontaine-les-Vervins, Франция) въз основа на техния етап на развитие и дължина.

4.3. Химикали и обезогенен тест за зебра при риби от зебра

Екстракт от зелен чай (GTE; PF-TP80), с общо съдържание на полифенол над 80% и съдържание на катехин над 70% (съдържание на EGCG над 40%), е закупен от Pharma Foods International Co., Ltd. (Киото, Япония). За експериментите GTE се разтваря в дестилирана вода, за да се получи 100 mg/ml основен разтвор. Работният разтвор се получава чрез приготвяне на 1/1000 разреден разтвор на изходния разтвор в 0,3X разтвор на Danieau.

Извършен е тридневен обезогенен тест за риба зебра, както е описано по-горе, с малки модификации [21]. Диаграмата на експерименталния дизайн е показана на фигура 1а. Накратко, ларвите на зебра са хранени със стандартна диета (Gemma Micro 75, последвана от Gemma Micro 150), докато не бъдат използвани в ZO теста. Избрани са ларви със стандартна дължина (SL; разстоянието от върха на рострала до основата на опашната перка) от приблизително 10 mm и са поставени в плоча с 6 ямки. Всяка ямка съдържа 5 ml 0,3X разтвор на Danieau и пет ларви. През първия ден от теста на ZO ларвите бяха хранени с 0,1% твърдо сварен пилешки яйчен жълтък като диета с високо съдържание на мазнини. На втория ден ларвите бяха изгладнели в контролната група и GTE групата беше изложена на работния разтвор на GTE. Обемът на ДДС е измерен преди и след гладуване или третиране с GTE чрез оцветяване с червено Нил.

За оцветяване с червено Нил се приготвя изходен разтвор от червено Нил (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) от 500 μg/ml в DMSO. Точно преди употреба, работният разтвор се получава чрез 1/100 разреждане на основния разтвор в 0.3X разтвор на Danieau. Ларвите бяха изложени на работния разтвор на червен Нил на тъмно в продължение на 30 минути при 28 ° С. След това рибите се изплакват два пъти с рибена вода в продължение на 5 минути, анестезират се в 500 ррт 2-феноксиетанол (Wako Pure Chemicals, Осака, Япония) и се наблюдават под флуоресцентен микроскоп BZ-X710 (Keyence, Токио, Япония). Положителният интензитет на Нил червен е количествено определен с помощта на софтуера ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.4. Лечение на възрастни Zebrafish

За перорално приложение на GTE на възрастни рибки зебра се приготвя 10% GTE-съдържаща храна от риба зебра, както е описано по-горе [45]. Възрастни женски данио (3-месечни) са разпределени на случаен принцип в три групи за лечение с пет риби на резервоар от 2 L (n = 5 на група): 1) нормална група за хранене - зебрите са хранени с нормална диета (глутенови гранули) през цялото време експерименталният период (3 седмици) и допълнително хранени 5 mg кисти/риба/ден на Artemia (саламура скариди) от втората седмица; 2) група с прекомерно хранене - зебрафите са хранени с нормална диета (глутенови гранули) в продължение на 3 седмици и прехранвани с 60 mg кисти/риба/ден на Artemia [24] от втората седмица; 3) GTE група - зебрафите са хранени с GTE-съдържаща храна (250 µg/g телесно тегло/ден) в продължение на 3 седмици и впоследствие прехранвани от втората седмица. Подробностите за храненето са показани в допълнителна таблица S4. Храната, съдържаща GTE, е хранена с риба зебра 30 минути преди хранене с Artemia. По време на храненето потокът от вода в резервоара беше спрян за 2 часа. Остатъците от Артемия се отстраняват веднъж дневно чрез прахосмукачка, за да се избегне замърсяването на водата. Дължината на тялото и телесното тегло се измерват всяка седмица. Кръвната глюкоза, плазмените TG и плазмените нива на TCHO бяха измерени в края на експеримента [46,47].

4.5. CT измерване на обема на ДДС

Зебрафите са евтаназирани чрез потапяне в баня с лед и вода (5 части лед/1 част вода при ≤4 ° C) за ≥20 минути и е извършено 3D микро-CT сканиране с помощта на in vivo System R mCT 3D micro-CT скенер (Ригаку, Токио, Япония), както е описано по-рано [14]. Триизмерните изображения бяха реконструирани и разгледани с помощта на софтуера i-View тип R (J. Morita Mfg, Киото, Япония) и визуализирани и анализирани с помощта на CT Atlas Metabolic Analysis ver. 2.03 софтуер (Rigaku). Измерването на обема на ДДС беше ограничено до коремната кухина, определена като зоната между клетрима и ануса.

4.6. Изолация на РНК, изграждане на библиотеки и последователност с висока производителност

Рибите бяха подложени на лапаротомия, незабавно прехвърлени в епруветки, съдържащи 3 ml RNAlater (Qiagen, Hilden, Германия), поставени при 4 ° C за 24 часа и след това съхранявани при -20 ° C до употреба. Чернодробните тъкани на пет риби от всяка група бяха изолирани чрез дисекция с помощта на форцепс, а общата РНК беше изолирана с помощта на реагент TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Общото съдържание на РНК беше измерено с помощта на Nano Drop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и целостта на пробите от РНК беше определена с помощта на Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ) . Рибозомната РНК беше изчерпана с помощта на комплект RiboMinus ™ Eukaryote System v2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) съгласно протокола на производителя. Целостта на РНК-изчерпаната РНК беше потвърдена с помощта на реагентите за анализ на Agilent RNA Pico и системата Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Пробите с нисък брой на РНК интегритет (RIN (199K, pdf)

Принос на автора

Всички автори са участвали в проектирането на експериментите. L.Z., H.N. и Y.S. извърши експериментите и анализира данни. L.Z. и J.K. извърши биоинформатичния анализ. L.Z. написа ръкописа. Y.K., D.C. и J.K. предостави GTE и даде съвети за настоящото проучване. Y.S. и Н.Н. замислил и проектирал експериментите. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.

Финансиране

Финансова подкрепа за това проучване беше предоставена от Rohto Pharmaceutical Co., Ltd.

Конфликт на интереси

Y.K., D.C. и L.J. са служители на фармацевтичната компания Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Други автори не декларират конфликт на интереси, пряко отнасящ се до съдържанието на този ръкопис.

Бележки под линия

Наличност на проба: Екстрактът от зелен чай се предлага от авторите.