Золтан Споларикс, богата на въглехидрати диета стимулира експресията на глюкоза-6-фосфат дехидрогеназа в чернодробните синусоидални ендотелни клетки на плъхове, Journal of Nutrition, том 129, брой 1, януари 1999 г., страници 105–108, https://doi.org/ 10.1093/jn/129.1.105

богата

Резюме

Глюкоза-6-фосфат дехидрогеназа (G6PD) 3 катализира първия и ограничаващ скоростта етап на хексозо-монофосфатния шунт (HMS). NADPH и пет въглеродни захари, произведени в HMS, са необходими за синтетични процеси и играят съществена роля в поддържането на клетъчния редокс статус (Cramer et al. 1995, Kletzien et al. 1994, Pandolfi et al. 1995, Spolarics 1998). Базалната експресия на G6PD варира в широки граници в тъканите, като най-ниска активност е показана в мускулите и най-голяма във фагоцитните клетки (Beutler 1990, Kletzien et al. 1994, Luzzatto and Mehta 1995). Експресията на G6PD може да бъде индуцирана от различни физиологични и патологични стимули; обаче, функционалното значение на повишената експресия на G6PD е различно при различните типове клетки (Kletzien et al. 1994, Spolarics 1998). В клетки с ограничен синтетичен капацитет като RBC, G6PD играе основна роля в елиминирането на реактивните метаболити на кислорода (Beutler 1990, Luzzatto и Mehta 1995). Последните изследвания обаче подчертават значението на G6PD за подпомагане на метаболизма на реактивни кислородни видове в чернодробните синусоидални клетки, както и в екстрахепаталните тъкани (Cramer et al. 1995, Kletzien et al. 1994, Pandolfi et al. 1995, Spolarics 1998 ). NADPH, генериран от HMS, е необходим за производството на супероксидни аниони и азотен оксид, докато елиминирането на тези видове или техните метаболити зависи и от HMS чрез глутатион пероксидази и каталаза (Spolarics 1998).

По-рано показахме, че G6PD е под дивергентна регулация в чернодробните клетки. Бактериалният ендотоксин in vivo стимулира експресията на G6PD в чернодробните ендотелни и Kupffer клетки, но не и в паренхимните клетки. Богата на въглехидрати диета стимулира експресията на G6PD в паренхимните клетки, в които повишената активност на HMS осигурява NADPH за синтез на ново ново съдържание на мастни киселини (Morikawa et al. 1984, Prostko et al. 1989, Volpe и Vagelos 1976). Няма налична информация за хранителната регулация на HMS в чернодробните синусоидални клетки. По този начин предположихме, че единичното копие на гена G6PD не се регулира еднакво от хранителните въглехидрати във функционално различаващи се клетъчни типове на чернодробната микросреда. В това проучване тествахме дали богата на въглехидрати диета променя експресията на G6PD в ендотелните и Kupffer клетки, когато се консумира за кратко време (48 часа).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Чернодробните паренхимни и синусоидални клетки бяха изолирани, както е описано по-рано (Spolarics 1996). Чистотата на синусоидалните и паренхимните клетки е> 94 и 99%, съответно; жизнеспособността на клетките, оценена чрез изключване на трипаново синьо, е> 95 и 90%, съответно. Общата клетъчна РНК от прясно приготвени клетки беше подложена на Northern blot анализ, както е описано по-рано (Spolarics and Navarro 1994). КДНК на плъх G6PD от Sprague-Dawley, подарък от Сюзън Стейпълтън (Университет на Западен Мичиган, Каламазу, Мичиган), бе етикетирана чрез случайно грундиране. Сигналите за хибридизация се определят количествено с помощта на анализатора Phosphorimager SI (Molecular Dynamics, Сънивейл, Калифорния). Стойностите бяха нормализирани до оптични плътности на 28S рРНК, оцветени с метиленово синьо преди хибридизации (Spolarics 1996).

Прясно изолирани чернодробни клетки бяха суспендирани в 50 mmol/L Tris буфер, pH 8.3, съдържащ 100 mmol/L KCl, 0.2 mg/ml Triton X-100, 0.01 mmol/L NADP + и коктейл от протеиназни инхибитори (Spolarics и Navarro 1994 ). Суспензията е обработена с ултразвук и пробите от 14 000 × g супернатанта са анализирани за G6PD и 6-фосфоглюконат дехидрогеназа (6PGD) дейности, както е описано по-рано (Spolarics и Navarro 1994).

ANOVA, последван от теста на Newman-Keuls, беше използван за оценка на данните. P-стойност ≤ 0,05 се счита за значима. Стойностите са средни ± sem.

РЕЗУЛТАТИ

Тествахме ефектите на различните диетични режими върху активността на G6PD в ендотелните и Kupffer клетки (Фиг. 1А). Определя се и активността на 6PGD, вторият NADPH-генериращ ензим в HMS (Фиг. 1В). Активността на ензимите също се определя в паренхимни клетки, приготвени от същия черен дроб, които служат като биологичен контрол (Фиг. 1C, D). Активността на G6PD [nmol NADPH/(min⋅mg клетъчен протеин)] в клетки от лишени от храна плъхове е 21,1 ± 2,2 в ендотелните, 8,9 ± 2,3 в паренхимните и 135,9 ± 6,1 в Kupffer клетките. Средната активност на 6PGD [nmol NADPH/(min⋅mg клетъчен протеин)] в клетки от лишени от храна плъхове е 24,5 ± 3,9 в ендотелната, 42,6 ± 3,4 в паренхимните и 136,5 ± 5,6 в Kupffer клетките. Ензимните дейности в останалите групи са изразени спрямо тези на лишените от храна плъхове.

Ефектът на богата на въглехидрати диета върху (А) глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа и (В) 6-фосфоглюконат дехидрогеназа дейности в синусоидални ендотелни и купферни клетки на плъхове. За сравнение са показани и резултати, получени в паренхимни клетки, изолирани от същия черен дроб (C, D). Ензимната активност се измерва в цитозола на прясно изолирани чернодробни клетки, получени от плъхове, отглеждани по различни хранителни режими. Резултатите се изразяват по отношение на активности в клетки от лишени от храна плъхове. Пръчките представляват средството ± sem, n = 6-8 независими клетъчни препарати. Различните букви над лентите показват значително различни средства, P Фиг. 1C, D) (Morikawa et al. 1984, Prostko et al. 1989, Volpe 1976). Разликите в активността на 6PGD, дължащи се на диетични лечения, са подобни на тези в G6PD в ендотелните и паренхимните клетки.

Високото въглехидратно хранене след лишаване от храна води до 300% по-високи концентрации на mRNA в стационарно състояние G6PD в ендотелните клетки в сравнение с клетките на лишени от храна плъхове (фиг. 2). Храненето на лишени от храна плъхове със стандартната диета не доведе до по-високи нива на G6PD иРНК в ендотелните клетки. В клетките на Kupffer богатата на въглехидрати диета не повлиява стационарните нива на G6PD иРНК, в съответствие с незасегнатата ензимна активност. Представителното петно ​​от паренхимни клетки, също изобразено на фигура 2, показва, че G6PD иРНК не се открива в паренхимните клетки от лишени от храна плъхове, докато прехранването с въглехидрати или стандартна диета увеличава нивото на иРНК на G6PD, в съгласие с по-рано публикувани наблюдения (Kletzien et 1994, Morikawa et al. 1984, Prostko et al. 1989, Volpe 1976).

Богата на въглехидрати диета стимулира изобилието на глюкоза-6-фосфат дехидрогеназа mRNA в синусоидалните ендотелни клетки на плъхове. Общата РНК от прясно изолирани чернодробни клетки беше подложена на Northern blot анализи. Сигналите на отделни мембрани се определят количествено чрез анализатор на фосфоизображения и се нормализират до оптични плътности на 28S рРНК, оцветени преди хибридизации. Резултатите се изразяват по отношение на сигнали в клетки от лишени от храна плъхове. Пръчките представляват средства ± sem, n = 4–7 независими клетъчни препарати. В горния панел е изобразена една представителна находка от Северно петно. За сравнение е показана и типична находка от паренхимни клетки. Различните букви над лентите показват значителни разлики, P Spolarics and Navarro 1994, Spolarics and Wu 1997). Повишената активност на G6PD в ендотелните клетки при предизвикване на захароза се придружава от повишени нива на иРНК, което предполага, че отговорният механизъм е генното активиране и/или повишена стабилност на иРНК в ендотелните клетки, подобно на това, наблюдавано в паренхимните клетки (Fritz et al. 1986, Manos et al. 1991).

Няма данни, показващи, че синусоидалните ендотелни клетки допринасят за синтеза на чернодробна мастна киселина de novo, което предполага, че повишенията в G6PD и 6PGD не са свързани със стимулиран анаболизъм на мастни киселини в тези клетки. Предлагаме, че отзивчивостта на ендотела към диетичната захароза е свързана с регулаторни механизми, които се задържат в ендотелните клетки, но се губят в клетките на Kupffer по време на тяхната диференциация. Разликата в инсулиновата чувствителност на тези клетки не е правдоподобно обяснение за различните отговори, тъй като и двата типа синусоидални клетки показват повишено усвояване на глюкоза след приложение на инсулин in vivo (Spolarics et al. 1992). Точният механизъм на действие на захарозната диета при активиране на гена G6PD също все още не е известен в паренхимните клетки (Kletzien et al. 1994). Следователно, механизмът, отговорен за различните реакции на чернодробните клетки, остава да бъде изяснен.

Диетите, съдържащи различни концентрации на наситени и полиненаситени мастни киселини, променят експресията на G6PD (Stabile et al. 1996, Taniguchi et al. 1994, Tomlinson et al. 1988) и модулират оксидативния взрив и окислително увреждане в макрофаги и белодробни ендотелни клетки (Eicher и McVey 1995, Guimaraes et al. 1992, Hart et al. 1991). Тъй като диетата, използвана в това проучване, причинява отлагане на липиди в черния дроб, остава да бъде изяснено дали натрупването на чернодробни липиди или диетичните или циркулиращи мастни киселини участват в индуцирането на експресията на G6PD в синусоидалните ендотелни клетки.

Взети заедно, тези проучвания показват, че в черния дроб, единичното копие на гена G6PD е под специфична за клетките регулация от хранителни въглехидрати. Отзивчивостта на тези клетки не е свързана с тяхното ендодермално или мезенхимно извличане или с присъщия им капацитет за синтез на мастна киселина de novo. Различията в сигналните пътища, действащи върху промотора на G6PD, уникалността на цитоплазмената среда, степента на клетъчна диференциация или придружаващото ниво на оксидативен стрес, всички те могат да бъдат отговорни за различните клетъчни реакции. Индуцираната от диетата повишена експресия на G6PD в ендотелните и паренхимните клетки може да модулира чернодробните реакции по време на ендотоксемия, сепсис или исхемия-реперфузия, когато оксиданти от набрани неутрофили или резидентни макрофаги насочват към синусоидалния ендотел и впоследствие към паренхима.

ПРИЗНАВАНИЯ

Благодарим на Jun-Xi Wu за отличната му техническа помощ и на Сюзън Стейпълтън за предоставената оригинална G6PD cDNA за проучванията.