Хранителна имунология

Редактиран от
Джия Слънце

Университет Дзяннан, Китай

Прегледан от
Чарлз Е. Маккол

Медицински център на баптистката Уейк Форест, САЩ

Патриша С. Лисабон

Държавен университет в Рио де Жанейро, Бразилия

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

съдържание

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Училище за приложни науки, Университет Кампинас, Лимейра, Бразилия
  • 2 Изследователски център за затлъстяване и съпътстващи заболявания, Държавен университет в Кампинас, Лимейра, Бразилия

Сепсисът е една от водещите причини за смърт при хоспитализирани пациенти, а хроничното и нискостепенно възпаление, наблюдавано при затлъстяване, влошава чувствителността и заболеваемостта от инфекции. Въпреки това, малко е известно по отношение на краткосрочната диета с високо съдържание на мазнини (HFD) и нейната роля в развитието на сепсис. Тук показваме за първи път, че краткосрочната консумация на HFD уврежда ранната субъединица α7 на никотинов ацетилхолинов рецептор (α7nAChR) - медиирана сигнализация, един от основните компоненти на холинергичния противовъзпалителен път, с фокус върху възпалението на хипоталамуса и вроденото имунен отговор. Мишките бяха рандомизирани на HFD или стандартна чау (SC) в продължение на 3 дни и впоследствие сепсисът беше индуциран чрез смъртоносна интраперитонеална (i.p.) инжекция на липополизахарид (LPS) или чрез операция за лигиране и пункция на cecal (CLP). В отделен експеримент и двете групи получават LPS (i.p.) или LPS (ip) във връзка със селективния агонист на α7nAChR, PNU-282987 (i.p. или интрацеребровентрикуларен; i.c.v.), и са жертвани 2 часа след предизвикателството. Краткосрочната консумация на HFD значително намалява нивата на mRNA на α7nAChR и протеините в хипоталамуса и черния дроб (стр -6 М разтвор) 80 минути след LPS предизвикателство и мишките бяха евтаназирани след още 40 минути.

Шансове за оцеляване

За да се определи степента на преживяемост, и двете групи (SC и HFD) се претеглят и се прилага смъртоносна доза LPS при 30 mg/kg i.p. както е описано по-рано (14). Едновременно с това се предизвиква сепсис при мишки, хранени с SC или HFD чрез CLP хирургия. Степента на оцеляване се записва на всеки 2 часа.

Екстракция на тъкани

Всички мишки бяха анестезирани (200 mg/kg BW кетамин и 5 mg/kg BW диазепам, i.p.) и впоследствие евтаназирани за екстракция на хипоталамуса, черния дроб и далака. Екстрахираните тъкани бяха бързо замразени върху сух лед за съхранение при -80 ° C до обработка за qRT-PCR или анализ на Western blotting.

Хирургия на лигатура на цекула и пункция (CLP)

Мишки, хранени с SC или HFD в продължение на 3 дни, бяха разделени на четири групи: SC-фалшив и HFD-фалшив (мишки, които получиха само лапаротомичен разрез), и SC-CLP и HFD-CLP (мишки, при които сепсисът беше индуциран от CLP).

Мишките получиха инхалационна анестезия и бяха подложени на надлъжен разрез в корема, така че цекумът им беше изложен извън перитонеалната кухина и лигирането се извършваше с копринена линия за зашиване. Експонираната цекума е пробита с игла и фекалното съдържание е екстравазирано в перитонеалната кухина. Впоследствие цекумът е поставен отново в първоначалното положение и коремът е зашит.

Като контрол за хирургичната променлива, другата половина от животните (HFD-Sham и SC-Sham) са били подложени само на лапаротомичен разрез в корема за експониране на цекума; обаче не е имало пункция или екстравазация на фекалното съдържание.

След процедурата животните бяха хранени със стандартна контролна диета в продължение на 24 часа и впоследствие умъртвени за събиране на хипоталамуса.

Стереотаксична хирургия и интрацеребровентрикуларна (i.c.v.) канюлация

Мишки, хранени с SC или HFD, получават i.p. инжектиране на анестезия, както е описано по-рано (15), и са поставени в стереотаксичен инструмент. След това 26-габаритна игла на 10-милилитрова спринцовка Хамилтън беше вкарана в страничната камера през отвор за черепно черепче при следните координати спрямо брегмата: предна/задна ос, 0,34 mm от брегмата към задната част; странично, на 1 мм от средната линия; дорзовентрална, на 2,2 mm от повърхността на черепа. Добавено е зъбно акрилно лепило за фиксиране на канюлата след правилно позициониране. След операцията на животните беше позволено да се възстановят от упойка на топла подложка. Поставянето на канюлата беше тествано чрез измерване на дипсогенния отговор на i.c.v. инжектиране на ангиотензин II (2 μl 10 -6 М разтвор) (Sigma-Aldrich, MO, САЩ). Времето и дозата на лечението с PNU-282987 са стандартизирани от експериментите с хода на времето и дозата (данните не са показани).

PCR анализ в реално време

Общата РНК се извлича от хипоталамуса, черния дроб и далака, като се използва реагент Trizol ® (Invitrogen Corporation, CA, USA), в съответствие с препоръките на производителя и се определя количествено, като се използва Nanodrop ND-2000 (Thermo Electron, WI, USA). Проведена е обратна транскрипция с 3 μg обща РНК и комплект за обратна транскрипция cDNA с голям капацитет (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA). Относителната експресия се определя, като се използва системата за откриване TaqMan ™ и праймери за целевите гени: Mm01312230_m1 за CHRNA7; Mm00443258_m1 за TNF-a; Mm00434228_m1 за IL-1β; Mm00446190_m1 за IL-6; Mm01288386_m1 за IL-10; Mm00657889_mH за Chil3; Mm00436450_m1 за CXCL2; Mm00441242_m1 за CCL2; и Mm00436454_m1 за CX3CL1 (Life Technologies Corporation, Карлсбад, Калифорния, САЩ). GAPDH се използва като ендогенен контрол (4352339E мишка GAPDH, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA). Всяка PCR реакция съдържа 20 ng кДНК. Експресията на гени се определя количествено чрез PCR в реално време, извършена на ABI Prism 7500 Fast платформа. Данните бяха анализирани с помощта на Sequence Detection System 2.0.5 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) и изразени като относителни стойности, определени чрез метода на сравнителния прагов цикъл (Ct) (2 – ΔΔ Ct), в съответствие с препоръките на производителя (16).

Западно петно

Имунофлуоресценция и конфокална микроскопия

ELISA за определяне на концентрацията на цитокини в серума и хипоталамуса

Изолираният хипоталамус и серумът бяха незабавно замразени (-80). Хипоталамусът се хомогенизира във физиологичен разтвор, буфериран с фосфат, допълнен с протеазни инхибитори в beadruptor ® при средна скорост за 15 s. След това пробите се центрофугират при 11 000 об/мин в продължение на 20 минути (4 ° С) за отстраняване на неразтворимия материал и за анализа се използва само супернатантата. Концентрациите на цитокини в хипоталамуса и серума (TNF-α и IL-1β) в супернатантите бяха оценени чрез ELISA, използвайки комплект Duo Set (R&D система) и IL6, използвайки IL-6 миши ELISA комплект (Thermofischer Scientific). Концентрациите се нормализират по количеството протеин в пробите, определено по метода, описан от Брадфорд.

Статистически анализ

Цитиране: Souza ACP, Souza CM, Amaral CL, Lemes SF, Santucci LF, Milanski M, Torsoni AS и Torsoni MA (2019) Краткосрочната консумация на високо съдържание на мазнини намалява хипоталамусната експресия на никотиновия ацетилхолинов рецептор α7 субединица (α7nAChR) и Засяга противовъзпалителния отговор при миши модел на сепсис. Отпред. Имунол. 10: 565. doi: 10.3389/fimmu.2019.00565

Получено: 19 май 2018 г .; Приет: 04 март 2019 г .;
Публикувано: 22 март 2019 г.

Джия Сун, Университет Дзяннан, Китай

Чарлз Е. Маккол, Баптистки медицински център на Уейк Форест, САЩ
Патриша Кристина Лисабоа, Държавен университет в Рио де Жанейро, Бразилия