• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

Резюме

Въведение

Колоректалният рак е сред най-честите човешки злокачествени заболявания (1) и е здраво свързан с хронично чревно възпаление, което поражда термина „рак, свързан с колит“ (2, 3). Развитието на асоцииран с колит рак при пациенти, страдащи от възпалителни заболявания на червата (IBD), е един от най-добре характеризираните примери за връзка между чревни възпаления и канцерогенеза (4–7). Сред пациентите с улцерозен колит е установено, че рискът от рак на дебелото черво е 2% на 10 години, 8% на 20 години и 18% на 30 години след първоначалната диагноза (4). За разлика от това, през целия живот рискът от спорадичен колоректален рак в САЩ е само 5% (8).

насърчава

Докато възпалението на червата е класически дефинирано хистопатологично, по-специално от наличието на имунни клетъчни инфилтрати, сега се оценява, че много по-честа форма на възпаление е „нискостепенно чревно възпаление“, което се определя от повишена системна експресия на провъзпалителни цитокини в отсъствие на класически агрегати на имунни клетъчни инфилтрати. Промените в отношенията между гостоприемник и микробиота са свързани и могат да насърчат нискостепенно чревно възпаление (19). Освен това все по-често се оценява, че нискостепенното хронично възпаление в червата може да стимулира метаболитни нарушения като диабет тип II, атеросклероза и затлъстяване, което само по себе си е свързано с повишена честота на рак на дебелото черво (20, 21).

Емулгаторите са подобни на детергент молекули, които се включват в повечето преработени храни за подобряване на текстурата и стабилността и наскоро демонстрирахме, че емулгаторите нарушават слуз-бактериалните взаимодействия, предизвиквайки чревно възпаление (22). В това скорошно проучване изследвахме ефекта на два често използвани емулгатора, а именно карбоксиметилцелулоза (CMC) и полисорбат-80 (P80), върху червата на гостоприемника. CMC е описан по-рано за насърчаване на свръхрастеж и възпаление на тънките черва при генетично чувствителни мишки (23), а P80 е способен да увеличи бактериалната транслокация през епитела in vitro (24, 25).

Тези два емулгатора са несмилаеми и се екскретират главно с изпражненията (26–29) и наскоро установихме, че както CMC, така и P80 насърчават посягането върху микробиотата и повишените нива на възпалителния флагелин и липополизахарид (LPS), което корелира с промяна в състава на микробиотата и чревно възпаление. Такива промени насърчават колит при мишки, генетично предразположени към това разстройство, и индуцират нискостепенно възпаление и метаболитен синдром при WT мишки. Важно е, че такива ефекти зависят от наличието на микробиота (не се наблюдава фенотип при мишки без микроби) и трансплантацията на фекална микробиота от третирани с емулгатори мишки на мишки без микроби, пренася някои характеристики на чревно възпаление и метаболитен синдром (22).

В настоящото проучване предположихме, че емулгаторите могат да участват в развитието на колоректален рак чрез насърчаване на нискостепенно чревно възпаление и промени в чревната микробиота. За да тестваме тази хипотеза, използвахме утвърдения миши модел на асоцииран с колит рак, използвайки канцерогена AOM, последван от два цикъла декстран сулфат натрий (DSS) при мишки, подложени на хронично излагане на два често използвани емулгатора, CMC и P80. Тук докладваме, че диетичните емулгиращи агенти създават и поддържат провъзпалителна среда в дебелото черво, свързано с промени в баланса на пролиферация/апоптоза, което води до влошена канцерогенеза. Тези промени са свързани и зависят от промени в състава и разнообразието на микробиотите, които създават благоприятна ниша за туморогенеза. Тези открития подкрепят концепцията, че нарушеното взаимодействие гостоприемник-микробиота, водещо до промени в чревната хомеостаза, може да насърчи канцерогенезата на дебелото черво.

Материали и методи

Материали

Натриевата карбоксиметилцелулоза (CMC, средна MW 50 250 000, степен на заместване = 0,7) и полисорбат-80 (P80) са закупени от Sigma.

В това проучване са използвани четири седмични мъжки мишки C57BL/6 WT. Всички мишки бяха отгледани и настанени в държавния университет на Джорджия (Атланта, Джорджия) съгласно институционално одобрени протоколи (IACUC # A14033). Мишките бяха настанени в специфични условия, свободни от патогени и хранени ad libitum с редовна чау диета. Животните, използвани на Фиг. 1–6 и допълнителна фиг. S1 – S10 бяха настанени в положителна стая на Helicobacter, а животните, използвани на фиг. 7 и допълнителна фигура S11, бяха настанени в отрицателна стая на Helicobacter.

Диетичните емулгатори променят пролиферацията и апоптозата на епителните клетки по зависим от микробиота начин. Конвенционалните и без микроби Swiss-Webster WT мишки бяха изложени на питейна вода, съдържаща CMC или P80 (1.0%) в продължение на 13 седмици. Чревна микробиота от конвенционални мишки Swiss-Webster WT, изложени на питейна вода, съдържаща CMC или P80 (1.0%) в продължение на 13 седмици, бяха трансплантирани на мишки Swiss-Webster WT без микроби. Анализ на циклин D1 (A и G), циклин D2 (Б. и З.), Ki67 (° С и Аз), BCL2 (д и J), ЛОШО (Е. и К) и експресия на VEGFA иРНК (F и L) чрез qRT-PCR в дебелото черво след третиране с емулгатор при условия без микроби (A – F) и след трансплантация на микробиота (G – L).

Лечение с емулгатор

Мишките бяха изложени на CMC или P80, разредени в питейната вода (1.0%). Същата вода (обработена с обратна осмоза градска вода в Атланта) се използва за обработената с вода (контролна) група. Тези решения бяха променяни всяка седмица. Теглото на тялото се измерва всяка седмица и се изразява като проценти от първоначалното телесно тегло (ден 0, дефиниран като 100%), за да се изследва ефектът на емулгатора върху наддаването на телесно тегло. Всяка седмица се събираха пресни изпражнения за анализ надолу по веригата.

Модел на рак, свързан с колит

Както е схематизирано в допълнителна фигура S11, третирани с емулгатори животни също се третират ежеседмично с AOM (10 mg/kg телесно тегло), разреден в PBS. В края на експеримента мишките бяха на гладно в продължение на 15 часа, беше извършена процедура за колоноскопия (Karl Storz Endoskope) и мишките бяха евтаназирани и органи събрани, както беше описано по-горе.

Експерименти без микроби

Швейцарските мишки Webster без микроби бяха държани при условия без микроби в изолатор Park Bioservices в нашето съоръжение без микроби. CMC и P80 се разреждат до 1% във вода и след това се автоклавират за цел без микроби. Същата вода беше използвана за обработената с вода (контролна) група. Успоредно бяха използвани традиционни швейцарски мишки Webster, съвпадащи с възрастта и пола. След 3 месеца лечение с емулгатор се провеждат терминални анализи.

Трансплантация на микробиота

Съдържанието на цекула от мишки, третирани с детергент Swiss Webster, се суспендира в 30% глицерол, разреден в PBS (1.0 mL) и се съхранява при -80 ° C до анализ. Швейцарските мишки Webster без микроби (на възраст 4 седмици) бяха отстранени от изолатора и им бяха приложени перорално 200 μL фекална суспензия, направена с помощта на глицеролови запаси. Трансплантираните мишки се наблюдават 3 месеца преди терминален анализ.

Анализ на миелопероксидаза на дебелото черво, количествено определяне на фекален Lcn-2 и серумни CXCL-1 и IL6 чрез ELISA

За подробности вижте раздела Допълнителни методи.

Количествено определяне на фекалния флагелин и LPS натоварване

Ние определихме количествено флагелин и LPS, както е описано по-горе (31), използвайки клетки на човешки ембрионален бъбрек (HEK) -Blue-mTLR5 и HEK-BluemTLR4, съответно (Invivogen). Ресуспендирахме фекален материал в PBS до крайна концентрация от 100 mg/mL и хомогенизирахме с помощта на Mini-Beadbeater-24 без добавяне на топчета, за да избегнем разрушаването на бактериите. Супернатантите се разреждат последователно и се прилагат върху клетки на бозайници. Пречистеният флагелин от E. coli и LPS (Sigma) бяха използвани за определяне на стандартна крива. След 24 часа стимулация, ние приложихме супернатант на клетъчна култура към QUANTI-Blue среда (Invivogen) и измерихме активността на алкална фосфатаза при 620 nm след 30 минути.

Екстракция на РНК, RT-PCR в реално време и количествено определяне на бактерии чрез qPCR

За подробности вижте раздела Допълнителни методи и Допълнителна таблица S1.

Анализ на фекална микробиота чрез секвениране на гена 16S rRNA, използвайки технологията Illumina и прогнозиране на метагенома

Секвенирането на 16S рРНК гени беше извършено, както е описано по-рано (22), с данни, депозирани в Европейския нуклеотиден архив под номер за присъединяване PRJEB8035. За подробности вижте Допълнителни методи.

Ki67 имунохистохимия

Проксималното дебело черво на мишката, лишено от тумор, беше фиксирано в 10% буфериран формалин за 24 часа при стайна температура и впоследствие вградено в парафин. Тъканите бяха разрязани с дебелина 5 μm и депарафинизирани. Секциите бяха инкубирани в натриев цитратен буфер и варени в тенджера под налягане в продължение на 10 минути за извличане на антиген. След това секциите бяха блокирани с 5% кози серум в TBS, последвано от едночасова инкубация с анти-Ki67 (1: 100, Vector Laboratories) при 37 ° С. След измиване с TBS, срезовете се третират с биотинилирани вторични антитела в продължение на 30 минути при 37 ° С и развитието на цвета се извършва с помощта на комплекта Vectastain ABC (Vector Laboratories). След това срезовете бяха оцветени с хематоксилин, дехидратирани и покрити. Ki67-положителни клетки бяха преброени на крипта.

Терминален деоксинуклеотидил трансфераза дезоксиуридин трифосфат ник-енд етикетиране

За да се изчисли броят на апоптотичните клетки в епителните клетки на дебелото черво, проксималното дебело черво на мишката, лишено от тумор, беше фиксирано в 10% буфериран формалин за 24 часа при стайна температура, вградено в парафин, разделено на дебелина 5 μm, депарафинизирано и оцветено за апоптотични ядра в съответствие с инструкциите на производителя, използвайки In Situ комплект за откриване на смърт на клетки (Roche Diagnostics). Терминални дезоксинуклеотидил трансфераза дезоксиуридин трифосфат никел-етикетиране (TUNEL) -положителни клетки, припокриващи се с ядрено оцветяване DAPI, се броят на крипта.

Статистически анализ

Данните са представени като средни стойности ± SEM. Значимостта се определя с помощта на t тестове, като всяка третирана група се сравнява с контролната група. Двупосочна групова ANOVA, коригирана за множество сравнения с помощта на Bonferroni posttest, беше използвана за телесно тегло във времето и анализ на алфа разнообразието (софтуер GraphPad Prism, версия 6.01). * и # показват статистически значими разлики.

Резултати

Диетичните емулгатори предизвикват нискостепенно чревно възпаление, свързано с метаболитен синдром

Множество котила на мишки бяха разделени еднакво при отбиването на три групи, които получават или вода, CMC или P80 в питейна вода (съответно 1,0% w/v или v/v) в продължение на 13 седмици, както се съобщава по-рано (допълнителна фигура S1; ref 22). В съответствие с предишната ни работа, консумацията на емулгатор доведе до характеристики на хронично чревно възпаление с ниска степен, включително скъсени дебело черво и спленомегалия (допълнителна фигура S2). Фекалният липокалин-2 (Lcn2), който е чувствителен и широко динамичен маркер на чревно възпаление при мишки (32), е използван за количествено определяне на чревното възпаление и показва, че третирани с емулгатори мишки показват повишени нива на фекален Lcn2 след 9 седмици на хранене консумация на емулгатор (ден 63; допълнителна фигура S2A – S2C), потвърждаваща индукцията на нискостепенно възпаление. Както се очакваше, както CMC, така и P80 предизвикаха умерено, но статистически значимо увеличение на телесната маса (допълнителна фигура S2D). Лечението с емулгатори също нарушава гликемичния контрол, както се оценява чрез концентрация на глюкоза на гладно (допълнителна фигура S2E) и е свързано с повишена консумация на храна (допълнителна фигура S2F), потвърждавайки предишното ни наблюдение, че емулгаторите предизвикват нискостепенно чревно възпаление и нарушават метаболизма на глюкозата (22).

Консумацията на емулгатор изостря канцерогенезата при модел на рак, свързан с колит

Диетичните емулгатори променят чревния микробиотен състав, което води до проинфламаторна чревна среда

Диетичните емулгиращи агенти нарушават пролиферацията/апоптозния баланс на епителните клетки

Диетичните емулгатори променят пролиферацията и апоптозата на епителните клетки по зависим от микробиотата начин

За по-нататъшно изследване как консумацията на емулгатори повлиява пролиферацията/апоптозата, ние след това анализирахме чрез qRT-PCR нивата на експресия на гените, които контролират пролиферацията (циклин D1, D2, Ki67), апоптозата (BCL2 и BAD) и ангиогенезата (VEGFA). Както е показано на фиг. 7, ние забелязахме, че след консумация на диетичен емулгатор, експресията на гени, кодиращи циклин D1, циклин D2 и Ki67, е значително дерегулирана (фиг. 7A-C), докато β-катениновият път е установен непроменен (Допълнителна фигура S10). В групите, третирани с AOM/DSS, нивата на експресия на тези гени бяха допълнително дерегулирани, без да се наблюдава разлика между групите, третирани с вода и емулгатори (данните не са показани). Анти- и проапоптотичните кодиращи гени Bcl2 и Bad (фиг. 7D и E) и маркерът за ангиогенеза VEGFA (фиг. 7F) остават непроменени при консумацията на емулгатора.