Център за изследвания и развитие на Medytox Gwangkyo, Medytox, Inc., Сувон, Корея.

Център за изследвания и развитие на Medytox Gwangkyo, Medytox, Inc., Сувон, Корея.

Център за изследвания и развитие на Medytox Gwangkyo, Medytox, Inc., Сувон, Корея.

Център за изследвания и развитие на Medytox Gwangkyo, Medytox, Inc., Сувон, Корея.

Адресна кореспонденция на: Yeung-Hyen Kim, PhD, Medytox Gwangkyo R&D Center, Medytox, Inc., 114 Central town-ro, Yeongtong-gu, Suwon-si 16506, Gyeonggi-do, Република Корея,

Център за изследвания и развитие на Medytox Gwangkyo, Medytox, Inc., Сувон, Корея.

Център за изследвания и развитие на Medytox Gwangkyo, Medytox, Inc., Сувон, Корея.

Резюме

Въведение

Затлъстяването е тясно свързано със сърдечно-съдови заболявания като артериосклероза, хипертония, сърдечни заболявания и диабет тип 2 и се причинява от комбинация от генетични, метаболитни, поведенчески и културни фактори. Консумацията на диета с високо съдържание на мазнини (HFD) е ключов фактор, причиняващ затлъстяването, а дългосрочното поглъщане на HFD води до увеличаване на телесните мазнини при бозайниците. 1 За управление на затлъстяването са разработени разнообразни диетични програми, лекарства и хирургични процедури. Тези подходи обаче често представляват проблеми с безопасността. По този начин е необходимо разработването на безопасни и ефективни терапевтични средства против затлъстяване, които да подпомогнат управлението на телесното тегло.

Доказано е, че чревната микробиота и затлъстяването са тясно свързани помежду си. 2 Чревната микробиота се различава между затлъстелите и слабите хора. Проучванията показват намаляване на Bacteroidetes филума и увеличаване Firmicutes филума при затлъстели хора, което предполага, че чревната микробиота играе важна роля в регулирането на метаболизма на мазнините. 3,4 Интересното е, че грам-отрицателните бактерии, Щамове Enterobacter cloacae, са наскоро идентифицирани при затлъстели мишки и се считат за патогенни бактерии в червата, което води до затлъстяване. 5

Пробиотиците са важни членове на чревната микробиота и оказват благоприятни ефекти, включително инхибиране на растежа на потенциални патогенни бактерии, подобряване на чревните функции, намаляване на метаболитните синдроми и регулиране на имунната система. 6–10 По-специално, модулацията на чревната микробиота чрез пробиотично лечение показва ефекти на затлъстяване, като намаляване на телесното тегло, активиране на метаболизма на мазнините и намаляване на нивата на кръвната глюкоза и хронично системно възпаление. 11–13 Въпреки това, ефектите срещу затлъстяването и антимикробните дейности на пробиотиците в E. cloacae-индуцирано затлъстяване не са докладвани. Следователно, в това проучване ние изследвахме функционалните ефекти от дългосрочното поглъщане на Lactobacillus plantarum LMT1-48 инча E. cloacae-индуцирани HFD-хранени мишки.

Материали и методи

Изолиране на млечнокисели бактерии от традиционни корейски ферментирали храни и фекални проби от новородени

За да изолираме млечнокисели бактерии (LAB), ние избрахме традиционни корейски ферментирали храни, включително кимчи, донгчими, джетгал и кисели краставички и събрахме фекални проби от новородени бебета. Пробите се смилат в блендер за 5 минути, последвано от разреждане на смлените сокове със стерилна дестилирана вода. След това пробите се разпространяват върху добавена към бромофенол синьо де Man, Rogosa и Sharpe (MRS; Difco Co., MI, USA) агарна плоча и се инкубират при 37 ° С в продължение на 48 часа. Колониите бяха избрани от кисели области (жълти) и идентифицирани с помощта на 16S rRNA секвениране (Macrogen, Inc., Сеул, Корея). Данните за секвениране бяха анализирани с помощта на инструмента за основно търсене на локално подравняване (BLAST) на библиотеката с данни на GENBANK (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Оценка на антимикробната активност на LABs срещу E. cloacae

Извършен е метод на дисково-дифузионен агар за изследване на антимикробната активност на LAB срещу E. cloacae (получено от Корейската колекция за типови култури, KCTC1685 или ATCC 11439). В този тест стерилни хартиени дискове (с диаметър 10 mm), съдържащи безклетъчни LAB супернатанти (100 μL) бяха поставени върху плочи от агар, върху които E. cloacae (10 6 колониеобразуващи единици [CFU]/ml) се поставят клетки и плаката се инкубира в продължение на 12 до 24 часа при 37 ° С. Ако LABs проявяват инхибиторни и бактерицидни ефекти, около хартиения диск се образува чиста зона E. cloacae растежът е бил възпрепятстван. 14 Тази област, наречена зона на инхибиране, беше измерена, за да се изчислят произволни единици на милилитър [AU/mL = (1000/d) × D, където D е коефициентът на разреждане и d е количеството на зареждане на пробата].

След това беше проведен експеримент за култивиране, за да се оцени антимикробната активност на LAB E. cloacae. За да се постигне това, LAB се култивират в MRS бульон в продължение на 24 часа при 37 ° С, след което културите се центрофугират при 9425 ж за 10 минути при 4 ° С. РН на LAB супернатантите след 24 часа е 3,95. По този начин използвахме рН от 3,95 като условие за контрол. Безклетъчните супернатанти от LABs или HCl при различни концентрации (0%, 5%, 10%, 15% и 20%) се култивират в присъствието на E. cloacae (10 6 CFU/ml) при рН 3,95 за 24 часа при 37 ° С. E. cloacae клетъчните номера бяха записани, за да се оцени антимикробната активност на LAB.

Характеристиките на L. plantarum LMT1-48

Да се ​​изследват характеристиките на L. plantarum LMT1-48 (KCTC регистриран идентификационен номер: KCTC13024BP; патент с регистрационен номер: KR101670048B1; GenBank номер за присъединяване: LC131441.1), който е изолиран от традиционните корейски ферментирали хранителни кимчи, ние оценихме морфологията на клетките, използвайки аналитично сканиране с висока разделителна способност електронна микроскопия (Carl Zeiss, Munchen-Hallbergmoos, Германия). Морфологичният анализ показа това L. plantarum LMT1-48 е пръчковидна, неподвижна и факултативна анаеробна бактерия (допълнителна фигура S1). Изображенията са направени в Корейския институт за фундаментални науки (KBSI; Национален университет Kangwon, Chuncheon, Корея).

На следващо място, модели на използване на въглехидрати и биохимични характеристики на L. plantarum LMT1-48 бяха оценени с помощта на аналитичен профилен индекс (API) 50 CHL комплект (bioMérieux, Inc., Marcy L'Etoile, Франция), който е добре утвърден метод за ръчна идентификация на микроорганизми на видово ниво. Подготовката на пробата се извършва съгласно инструкциите на производителя. Накратко, L. plantarum LMT1-48 се смесва с буфера и мътността му в суспензия се коригира, използвайки стандарта McFarland. Коригираното L. plantarum LMT1-48 суспензия се инокулира върху всяка лента от API 50 CHL комплекта, преди да се добави минерално масло. Инокулираните L. plantarum LMT1-48 се инкубира при 37 ° С и се наблюдават реакции след инкубиране за 6 до 12 часа. L. plantarum LMT1-48 нараства бързо в присъствието на d -глюкоза, d -фруктоза, d -маноза, d-рибоза и н-ацетилглюкозамин, което показва, че тези хранителни вещества са основни източници на енергия за L. plantarum LMT1-48 (допълнителна таблица S1).

След това проверихме идентификацията на L. plantarum LMT1-48 чрез 16S rRNA генно секвениране. Подробности за подготовката на пробите са описани в раздела Пиросеквениране на фекалната микробиота в раздела Материали и методи. Изолираните L. plantarum LMT1-48 беше най-добре съчетан (99,93% идентичност) с L. plantarum ATCC 14917 (номер за присъединяване към GenBank: AJ965482).

Модели на животни

Мъжки мишки C57BL/6N са закупени от OrientBio, Inc. (Seongnam-si, Корея). Всички мишки бяха държани в специфичното съоръжение без патогени в университета CHA (Seongnam-si, Корея) и използвани на 5-седмична възраст. Всички експерименти с животни са извършени съгласно протокол, одобрен от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към университета CHA (IACUC160121).

Проектирахме четири различни експериментални модела на затлъстяване при животни и използвахме поне пет мишки на група. Мишките от групата с отрицателен контрол (NCD група) са били хранени с нормална диета с чау (NCD) (сертифицирана от Teklad облъчена глобална 18% протеинова диета за гризачи, 2918C; Envigo, Великобритания) в продължение на 10 седмици. Мишките от групата с положителен контрол (HFD група) са хранени с нормална чау-диета в продължение на 2 седмици и след това са снабдени с HFD (диета, индуцирана от затлъстяване, пречистена диета с/45% енергия от Fat Red) за още 8 седмици. За мишки от групата на патогенното бактериално затлъстяване (EC [Enterobacter cloacae] група), грам-отрицателни бактерии E. cloacae щамове (10 8 CFU/ден) се доставят при същите условия като положителната контролна група. И накрая, за оценка на ефектите от затлъстяването, L. plantarum LMT1-48 щамове (10 9 CFU/ден) бяха доставени на мишки в E. cloacae-индуцирана група за затлъстяване в продължение на 10 седмици (група LMT1-48). E. cloacae и L. plantarum Щамовете LMT1-48 бяха прясно приготвени и орално прилагани ежедневно. След 10 седмици мишките бяха умъртвени и проби от серум и фекалии бяха събрани, за да се анализират съответно нивата на хормоните и микробиомният състав.

Измерване на лептин, общ холестерол и липопротеин с висока плътност в миши серум

За да се анализират нивата на серумен хормон, кръвта се събира от каудалната вена кава с помощта на епруветка, покрита със съсирек, и се центрофугира при 2000 ж за 15 минути при 4 ° С. Общите нива на холестерола и липопротеините с висока плътност (HDL) в серумни проби бяха определени с помощта на автоматичен хематологичен анализатор (Beckman coulter, Калифорния, САЩ). Нивата на лептин в серумни проби се определят с помощта на набор за анализ на имуносорбентен анализ за мишки лептин (ELISA) (Abcam, Inc., Cambridge, United Kingdom).

Пиросеквениране на фекалната микробиота

Проби от фекалии на мишки бяха събрани от всяка група (NCD, HFD, EC и LMT1-48). Геномна ДНК се извлича от фекални проби и се анализира чревната микробна общност. Последователността на Illumina се извършва в Macrogen, Inc. (www.macrogen.com), базирана в Сеул, Корея. Всяка секвенирана проба се приготвя съгласно протоколите на библиотеката за метагеномно секвениране Illumina 16S за усилване на регионите V3 и V4 (519F-816R). Използваните за усилване последователности от баркодирани фузионни грундове бяха както следва: 314F: 5 ′ CCTACGGGNGGCWGCAG 3 ′, 806R: 5 ′ GACTACHVGGGTATCTAATCC 3 ′. След това крайният пречистен продукт беше количествено определен чрез количествена полимеразна верижна реакция в реално време (qPCR) съгласно ръководството за протокол за количествено определяне на qPCR (KAPA Library Quantification kit for Illumina Sequencing platform, San Diego, CA, USA) и квалифициран с помощта на LabChip GX HT DNA Комплект за висока чувствителност (PerkinElmer, MA, САЩ). След това секвенирането на сдвоени краища (2 × 300 bp) беше извършено от Macrogen, използвайки платформата MiSeq ™ (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ), съгласно стандартните протоколи. За анализ на данни последователностите на сдвоени краища впоследствие бяха обединени с помощта на софтуер FLASH (v.1.2.11). 15 висококачествени последователности бяха предварително обработени и групирани с помощта на софтуера CD-HIT-OUT. 16 Анализът на разнообразието и таксономията на общността на микробиотите беше извършен с помощта на софтуера QIIME (v.1.8.0). 17

Микрокомпютърен томографски анализ

Масата на телесните мазнини на пет представителни мишки от всяка група се анализира със система за микрообразяване (NFR Polaris G90; NanoFocusRay Co. Ltd., Suwon-si, Корея). Триизмерните (3D) изображения бяха реконструирани с помощта на софтуер за 3D анализ (Amira5.4.1, Visage Imaging GmbH, Германия). Областите на мастната тъкан са изчертани върху коремните подкожни и висцерални мастни тъкани на нивото на прешлените (L2-L3 регион).

Статистически анализ

Данните за всички експерименти бяха анализирани с помощта на софтуер Prism (Prism, версия 7; софтуер GraphPad, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Сдвоен студент т-тестът е използван за сравнение на експериментални групи; P стойностите се считат за статистически значими, ако *P

lmt1-48

Фиг. 1. Антимикробна активност на LAB срещу бактерии, предизвикващи затлъстяване. (А) Схематично представяне на скрининговия метод, използван за определяне на антимикробната активност на LAB. (Б) За да се избере щамът LAB, показващ най-голяма антимикробна активност, дейностите на щамовете LAB се оценяват с помощта на дисково-дифузионен агарен метод, както е описано в раздела Материали и методи. Сравнени са зоните на инхибиране, произведени от щамове LMT1-30, LMT1-48 и LMT2-46. (° С) За да се оцени антимикробната активност на LABs, безклетъчните супернатанти от избрани LABs се култивират с Enterobacter cloacae както е описано в раздела Материали и методи. E. cloacae броят на образуващите колонии единици, получен в различни LAB кокултури, беше сравнен. Областта под кривата е използвана за допълнителна оценка на антимикробните ефекти на LAB. Лентите за грешки представляват средната стойност ± SEM. *P

Таблица 1. Антимикробна активност на избрани млечнокисели бактерии срещу индуциране на затлъстяване Enterobacter cloacae Бактерии

След това изследвахме дали антимикробната активност на LABs се дължи на киселинни промени на pH или действието на техните метаболити в супернатантите. РН на LAB супернатантите след 24 h култура е 3,95. Поради това тествахме антимикробната активност на LABs срещу E. cloacae чрез култивиране при фиксирани условия при pH 3,95. LAB или HCl безклетъчни супернатанти в различни концентрации (0%, 5%, 10%, 15% и 20%) бяха култивирани в присъствието на E. cloacae за 24 часа. Броят на E. cloacae CFU драстично намалява в присъствието на трите избрани LABs в сравнение с този в контролната HCl група (Фиг. 1C, ляв панел). Площта под кривата (AUC) беше изчислена за сравняване на антимикробната активност на LAB в сравнение с тази на контролната група за HCl супернатант. Най-високата антимикробна активност срещу E. cloacae се наблюдава в L. plantarum LMT1-48 група (фиг. 1C, десен панел).

Ефекти от затлъстяването на L. plantarum LMT1-48 инча E. cloacae-индуцирани HFD-хранени мишки

За оценка на ефектите от затлъстяване на L. plantarum LMT1-48 на E. cloacae-индуцирано затлъстяване, ние проектирахме четири различни условия на хранене, както е показано на фигура 2А. Дългосрочното хранене с HFD причинява по-високо телесно тегло при HFD-хранени мишки (34,6 ± 0,5 g), отколкото при NCD-хранени мишки (25,7 ± 0,5 g). Администрация на E. cloacae на мишки от групата с HFD причинява леко увеличение на телесното тегло в сравнение с групата само с HFD, докато наличието на L. plantarum LMT1-48 значително понижава телесното тегло (36,0 ± 1,2 g в групата на ЕС и 29,4 ± 0,9 g в групата LMT1-48, фиг. 2В). Следователно, след това измерихме обема на мазнините, използвайки сканираща машина с микрокомпютърна томография (CT), за да оценим промените в обема на коремните мазнини при индуцирани от диета затлъстели мишки. Администрацията на L. plantarum LMT1-48 драстично намали обема на коремните мазнини през E. cloacae-индуцирани HFD-хранени мишки (Фиг. 2С). Представително позитронно-емисионна томография/CT изображение е представено на фигура 2D, с коремна мазнина, изобразена в кафяво.

Фиг. 2. Ефекти от затлъстяването на Lactobacillus plantarum LMT1-48 инча E. cloacae-индуцирани затлъстели мишки. (А) Схематично представяне на използваните експериментални модели на затлъстели животни, както е описано в раздела Материали и методи. (B, C) Телесно тегло (Б) и обема на мазнините (° С) бяха измерени, за да се оценят ефектите от затлъстяването на Lactobacillus plantarum Администрация на LMT1-48. н = 5 мишки на група. (Д) Представително изображение на микрокомпютърна томография на коремна мастна секция (L2 – L3 област). Коремната мазнина е изобразена в кафяво. Лентите за грешки представляват средната стойност ± SEM. *P

Проучванията показват, че консумацията на HFD повишава нивата на лептин и TC в плазмата. 18–20 Следователно ние оценихме тези параметри в нашите модели. Администрация на L. plantarum LMT1-48 значително намалява нивата на лептин и ТС в плазмата (фиг. 3А, В). Нивата на HDL са увеличени в сравнение с тези в групата с NCD, но са сравними с тези в групите с HFD и EC (Фиг. 3C). Следователно тези данни показват, че администрирането на L. plantarum LMT1-48 произвежда ефект на затлъстяване, придружен от намаляване на нивата на лептин и TC в E. cloacae-индуцирани HFD-хранени мишки.

Фиг. 3. Серумни нива на адипокини и липиди. Функционални ефекти на L. plantarum LMT1-48 лечение в E. cloacae-индуцирани затлъстели мишки. Серумни нива на лептинов хормон (А), общ холестерол (Б), и липопротеин с висока плътност (° С) бяха измерени с ELISA. Серумните проби бяха събрани от различните експериментални групи, както е показано на Фигура 1. н = 5 мишки на група. Лентите за грешки представляват средната стойност ± SEM. *P

L. plantarum LMT1-48 влияе върху разнообразието на чревната микробиота

Проучихме дали администрирането на L. plantarum LMT1-48 повлиява разнообразието на чревната микробиота в E. cloacae-индуцирани HFD-хранени мишки. Разнообразието на чревната микробиота от фекални проби е по-голямо в групата LMT1-48, отколкото в други групи (фиг. 4). По-специално, на ниво тип, Verrucomicrobia и Протеобактерии са се увеличили драстично в групата LMT1-48 (съответно 1,62% и 2,75%) в сравнение с групата на ЕС (съответно 0% и 0,29%) (Фиг. 4). Следователно прилагането на L. plantarum LMT1-48 може да помогне за насърчаване на разнообразието на чревната микробиота, което води до подобряване на затлъстяването през E. cloacae-индуцирани HFD-хранени мишки.

Фиг. 4. Модулация на микробиотичната общност от L. plantarum LMT1-48. Относителното изобилие на бактериална фила във фекалиите се измерва, като се използва 16S rRNA пиросеквенция, както е описано в раздела Материали и методи. * The Акермансия род, който е най-представителният род от типа Verrucomicrobia. # Протеобактерии. Цветните изображения са достъпни онлайн.

Дискусия

Проучванията също така показват, че пробиотиците, произвеждащи късоверижни мастни киселини (SCFA), проявяват свойства на затлъстяване, като регулират метаболизма на липидите и глюкозата, 29–31 намаляват размера на адипоцитите, 32 намаляват холестерола и регулират нивата на лептин. 33 Както е показано в това проучване, L. plantarum LMT1-48 показа антимикробни свойства срещу E. cloacae, което може да е резултат от различни компоненти, като SCFA, секретирани от L. plantarum LMT1-48, а не прости промени в рН, предизвикани от бактериален растеж. Необходими са обаче допълнителни проучвания за оценка на ефикасността на SCFA, произведени от L. plantarum LMT1-48 при индуцирани от диета затлъстели мишки.

В обобщение, това е първият доклад, демонстриращ ефектите от затлъстяването на L. plantarum LMT1-48 на E. cloacae-индуцирани HFD-хранени мишки. Въпреки че са необходими допълнителни проучвания за изясняване на клиничната функция на регулирането на мазнините в човешкото тяло чрез L. plantarum LMT1-48, тези бактерии са добри кандидати за функционални здравословни храни или като нов терапевтичен агент за затлъстяване.