Принос от Ян Л. Бреслоу

механизъм

Резюме

Животните бяха настанени в стая с контролирана влажност и температура с 12-часов тъмен/12-часов цикъл на светлина в Лабораторния център за изследвания на животни в университета Рокфелер. Освен ако не е посочено друго, животните са били хранени в продължение на 3 седмици с гранула Picolab (Bouncbrook, NJ) Rodent Chow 20 (5053), съдържаща 0,02–1% (тегл./Тегл.) Холестерол. Обогатяването с холестерол се постига чрез разтваряне на кристализирания холестерол в етилов етер, който след това се смесва с чау диета (0,02% холестерол) и се сервира на животни под формата на пелети.

Измервания на абсорбцията на холестерол.

Измервания на диетичния прием на холестерол и абсорбцията на маса на холестерола.

Приемът на храна се измерва чрез претегляне на храната преди и 24 часа след поставянето на животните в метаболитни клетки. Диетичният прием на холестерол се изчислява чрез умножаване на приема на храна по процента на холестерола в диетата и изразен като mg холестерол/g телесно тегло на ден. Масата на диетичния холестерол, абсорбиран ежедневно от червата, се изчислява чрез умножаване на стойността за приема на диетичен холестерол по процент на диетична абсорбция на холестерол и изразена като mg холестерол/g телесно тегло на ден.

Аспирация на жлъчката и измерване на съдържанието на холестерол в черния дроб.

Мишките се гладуват в продължение на 6 часа и след това се анестезират. Коремната кухина беше изложена през вентрален разрез и се аспирира жлъчката на жлъчния мехур. Жлъчката се съхранява при 4 ° С и се анализира в рамките на 14 дни за съдържание на холестерол, жлъчна киселина и фосфолипиди, както е описано по-долу. Черният дроб се събира, претегля и хомогенизира в 2 ml ddH2O и се добавя предварително определено количество копростанол като вътрешен стандарт за газова хроматография. След хомогенизиране бяха добавени 5 ml хлороформ/метанол (2: 1, обем/обем), пробите бяха енергично завихрени и центрофугирани и органичната фаза беше прехвърлена и разделена на две отделни, пресни епруветки. В една епруветка се провежда хидролиза на холестеролов естер чрез добавяне на 2 ml 1 М КОН в 95% етанол и нагряване в продължение на 1 час при 85 ° С. Хидролизираните и нехидролизираните проби се инжектират върху напълнена капилярна колона от силициев диоксид в течен хроматограф Perkin– Elmer газ – течност за съответно измерване на общия и свободния холестерол. Естерът на холестерола се изчислява като разлика между общия и свободния холестерол. Данните са изразени като mg холестерол/g мокро тегло на черния дроб.

Анализ на състава на жлъчката.

Билиарният холестерол и жлъчните киселини се измерват ензимно с помощта на търговски комплекти Sigma Diagnostics (съответно 352 и 450-A), а фосфолипидите се измерват с помощта на комплект Wako Commercial GmbH.

Измервания на холестерол 7а-хидроксилаза и чернодробна хидрокси-3-метилглутарил КоА редуктаза (HMGR) Дейности.

Анализ на фекалната жлъчна киселина.

Смес от 25 mg лиофилизирани изпражнения и нор-дезоксихолова киселина (9,5 μg в 100 μl метанол) се добавя към 1 ml 0,5 N натриев хидроксид и се загрява при 60 ° С в продължение на 1 час. След охлаждане до стайна температура продуктите се разреждат с 1 ml вода и се екстрахират четири пъти с 2 ml хексан. Водната фаза се охлажда в лед, подкислява се с 50% солна киселина до рН 1 и се екстрахира четири пъти с 3 ml етилацетат. Органичният слой се промива с вода до неутралност и се изпарява при 55 ° С под азот. Продуктът се третира с 3% метанолна солна киселина в продължение на 4 часа при стайна температура, разтворителят се изпарява при 55 ° С под азот и остатъкът се подлага на триметил силилиране със 100 μl Sil-Prep (Alltech Associates) в продължение на 30 минути при 55 ° С. След изпаряване под азот, образуваните триметил силилетер етер-метилови естери се разтварят в 200 μl хексан и 1-2 μl се използват за газово-течна хроматография (27). При необходимост масовите спектри на триметил силил етер-метиловите естери на жлъчните киселини се определят, както е описано по-горе (28).

РЕЗУЛТАТИ

Първият експеримент е предназначен да изследва времевия ход на екскрецията на фекален β- [3 H] ситостанол и [14 C] холестерол в мишката. В този експеримент животните бяха поставени в метаболитни клетки и обезкостени с белязана смес, а изпражненията се събират ежедневно в продължение на 4 последователни дни и се обработват, както е описано в Методи. Както е показано на фиг. 1, при тези условия повече от 98% от фекалния β- [3Н] ситостанол и 86% от [14 С] холестерол се възстановяват през първите 24 часа от събирането на изпражнения. Това показва, че 24-часово събиране е достатъчно за измерване на абсорбцията на холестерол в мишката и това се използва за всички следващи експерименти.

Ежедневна фекална екскреция на [3 H] β-ситостанол и [14 C] холестерол. Мъжете на C57BL/6 се дават с [3 H] β-ситостанол и [14 C] холестерол и се поставят в метаболитни клетки, а изпражненията се събират ежедневно в продължение на 4 последователни дни. Начертава се процентът на ежедневна екскреция на [3 H] и [14 C] от общия брой на всеки етикет, възстановен във фекалиите за 4 дни (средно ± SD, n = 5).

За да се изследва механизмът на регулиране на диетичната абсорбция на холестерол, мишките C57BL/6 са хранени с нарастващи количества холестерол и при всяко ниво на диетичен холестерол е измерен процентът на абсорбция. Както е показано на фиг. 2А, с увеличаване на диетичния холестерол се наблюдава постепенно намаляване на процента на абсорбирания диетичен холестерол. В сравнение с диетата с 0,02% холестерол, диетата с 1% холестерол има 50% намаляване на процента на абсорбирания диетичен холестерол. Поставянето на масата на диетичния холестерол, абсорбиран на ден спрямо процента от теглото на холестерола в диетата, дава наситена крива, характеризираща се с Km от 0,4% тегл./Тегл. И Vmax от 0,65 mg холестерол/g телесно тегло на ден, както е показано на фиг. 2В. По този начин при мишките C57BL/6 абсорбцията на диетичен холестерол изглежда е наситен процес.

Ефект от остър хранителен превключвател на холестерола върху процентното усвояване на холестерола. C57BL/6 мишките бяха предварително кондиционирани за 3 седмици с 0.5% холестерол и беше измерена абсорбцията на холестерол (твърда лента). Същите животни бяха хранени за допълнителни 3 седмици със същата диета, дадени с радиоактивно маркирана смес и превключени веднага след това в 0,02% холестерол. През следващите 24 часа, докато се консумира 0,02% холестеролна диета, се събира изпражненията и се измерва абсорбцията на холестерол (отворена лента). (Средно ± SD, n = 5.)

Ефект на диетичния холестерол върху чернодробната HMGR и 7α-хидроксилазната активност и състава на жлъчката. Мишките C57BL/6 бяха хранени с нарастващи количества холестерол в продължение на 3 седмици. Жлъчката на жлъчния мехур беше аспирирана и анализирана. Дейностите на HMGR (■) и холестерол 7α-хидроксилаза (○) бяха определени в изолирани чернодробни микрозоми. Билиарният холестерол (•) и жлъчните киселини (▴) бяха измерени, както е описано в Методи (средно ± SD, n = 5).

Връзка на процента на абсорбция с билиарния холестерол. Мишките C57BL/6 бяха хранени в продължение на 3 седмици с 0,02–1% холестерол. Измерва се абсорбцията на холестерол и се аспирира жлъчката на жлъчния мехур и се измерва съдържанието на холестерол.

Тази хипотеза беше допълнително тествана чрез изучаване на абсорбцията на холестерол при SR-BI Tg животни. Ние предположихме, че стимулирането на екскрецията на HDL холестерол в жлъчката ще потисне усвояването на диетичния холестерол при тези животни. Както е показано в Таблица 1, свръхекспресията на SR-BI значително повишава билиарните концентрации на холестерола (141 ± 7 и 195 ± 28 mg/dl в контрола и SR-BI Tg, съответно; P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Състав на жлъчката и абсорбция на холестерол при 0,02% хранени с холестерол контролни и SR-B1 Tg животни

ДИСКУСИЯ

Резултатите от настоящото проучване категорично предполагат, че диетичната абсорбция на холестерол е наситен процес и хвърля светлина върху механизма. При мишки C57BL/6 нарастващите количества диетичен холестерол намаляват процента на абсорбирания диетичен холестерол. Това намаление корелира най-добре с повишаване на концентрацията на холестерол в жлъчката, което от своя страна изглежда е повлияно от общия дневен прием на холестерол в храната, дневната масова абсорбция на диетичен холестерол и съдържанието на естер на холестерола в черния дроб. В мишката SR-BI Tg повишените концентрации на жлъчен холестерол водят до подобни явления, например, намален процент на диетична абсорбция на холестерол. Взети заедно, тези резултати при мишки C57BL/6 и SR-BI Tg предполагат причинно-следствена връзка между повишеното съдържание на жлъчен холестерол и феномена на наситеност на диетичната абсорбция на холестерол.

След хранене с нарастващи количества диетичен холестерол, отчитат намаляване на ефективността на абсорбция на диетичен холестерол от други при мишки (8, 9), маймуни (10) и хора (11), но механизмът не е определен. Quintao et al. (11), в проучвания при хора, първоначално предполага, че това явление се дължи на обмен на белязан с немаркиран холестерол в чревния лумен, което води до намаляване на абсорбцията на белязан холестерол при диета с високо съдържание на холестерол. Въпреки това, в последващи проучвания, Самуел и Макнамара (13) показват, че приносът на чревната лигавица към луминалния холестерол, чрез обмен на изотоп или секреция на холестерол, е минимален и следователно не може да обясни промените в процента на абсорбирания хранителен холестерол. Нашите експерименти, при които животните, подготвени с висок хранителен холестерол, са преминали на нисък хранителен холестерол и не успяват да увеличат процента на абсорбция (фиг. 3), категорично се аргументират срещу такава възможност.

Данните, представени в настоящото проучване, категорично показват, че потискането на процента на усвояване на диетичния холестерол чрез хранене на нарастващи количества диетичен холестерол се причинява от промени в състава на жлъчката. По-конкретно, бихме могли да покажем при мишки от див тип, че при широк диапазон на диетичен прием ефективността на усвояване на диетичния холестерол от червата е силно обратно свързана с концентрацията на холестерол в жлъчката (фиг. 5). Нашата хипотеза се подкрепя допълнително от проучвания върху мишката SR-BI Tg. Докато са на диета с чау, тези животни показват силно намалени нива на HDL холестерол в плазмата и 6- до 7-кратно увеличение на фракционната катаболна скорост на HDL холестерилов естер в черния дроб (NW, Takeshi Arai, Yong Ji, Franz Rinninger и ART, непубликувани данни) което предполага, че HDL холестеролът представлява основният източник на жлъчен холестерол при тези животни. Тези наблюдения предоставят сериозни доказателства, че екскрецията на холестерол в жлъчката, независимо дали е от диетични или ендогенни (напр. HDL холестерол) източници, играе важна роля за регулиране на ефективността на диетичното усвояване на холестерола.

В обобщение, в настоящото проучване използвахме модел на мишка, за да покажем, че ефективността на диетичното усвояване на холестерола е свързана с контрола на екскрецията на холестерол в жлъчката. Ако подобни механизми действат при хората, тогава изясняването на молекулярните събития, които са в основата на екскрецията на холестерол в жлъчните пътища, може да доведе до нови прозрения в разбирането за реакцията към диетичния холестерол и евентуално нови подходи за профилактика на атеросклеротични заболявания.