Хранителна микробиология

Тази статия е част от изследователската тема

Напредък в патологията на плодовете и зеленчуците след прибиране на реколтата Вижте всички 17 статии

Редактиран от
Ненгуо Тао

Университет Ксиантан, Китай

Прегледан от
Xingfeng Shao

Университет Нингбо, Китай

Джун Тиан

Нормален университет Джиангсу, Китай

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

микотоксин

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • Колеж по хранителни науки и инженерство, Китайски университет в Оушън, Кингдао, Китай

Патулинът е често срещан замърсител в плодовете и зеленчуците, който трудно се отстранява. В това проучване е изследвано биоразграждането на патулин с помощта на свински панкреатична липаза (PPL). Методът на HPLC е използван за анализ на концентрацията на патулин. Проведени са експерименти с разграждане на партиди, за да се илюстрира ефектът от количеството PPL, рН, температура, време на контакт и първоначална концентрация. Освен това продуктът от разграждането на патулина се характеризира със сканиране с пълна дължина на вълната и MS технологии. Резултатите показват, че оптималните условия на разграждане на PPL за патулин се наблюдават при рН 7,5, 40 ° С в продължение на 48 часа. Процентът на разграждане може да достигне над 90%. Структурата на разграждащия се продукт на патулин беше изведена от молекулното тегло 159.0594, наречено C7H11O4 +. Той посочва, че PPL е ефективен за разграждането на патулина в сока от плодове и зеленчуци.

Въведение

Патулин (4-хидрокси-4Н-фуро [3, 2в] пиран-2 [6Н] -он), замърсяване с микотоксини, се синтезира от различни гъбички, особено Пеницилиум, Aspergillus, и Бисохламис видове (Moake et al., 2005; Castoria et al., 2011; Zhu et al., 2015) (Фигура 1). Тези гъби са важни патогени след прибиране на реколтата на ябълки, круши, праскови, кайсии, както и някои зеленчуци (напр. Домати) и причиняват натрупване на патулин в заразени продукти (Yuan et al., 2010; Castoria et al., 2011) . Патулин представлява риск за здравето на хората и добитъка след остри и хронични ефекти, дори при относително ниска концентрация (Moake et al., 2005; Zhu et al., 2015; Peng et al., 2016). Поради неговата токсичност много страни и организации, включително Китай и СЗО, са установили временно максимално допустимото ниво на замърсяване с патулин за продукти, получени от плодове и зеленчуци (Организацията за хранително земеделие/Световната здравна организация [FAO/WHO], 1995; Кастория и др., 2005; Yuan и сътр., 2010). Следователно е необходимо да се отстрани патулинът от храните.

ФИГУРА 1. Молекулярна структура на патулина.

Структурата на патулина разкрива наличието на лактонова връзка. Следователно намаляването на ензимите като тези, участващи във ферментацията на дрожди, както и разграждащите лактон ензими като лактамаза, може да са в състояние да разграждат само патулин (Moake et al., 2005). Тази статия се фокусира върху изследването на ефекта на ензимите за разграждане на патулина.

Липази (хидролази на триацилглицеролов естер; E.C. 3.1.1.3) се намират в микроорганизми, растения и животински тъкани. Сред тях, свинската панкреатична липаза (PPL) е една от най-широко използваните липази при катализиране на различни реакции, като естерификация, переетерификация и хидролиза, която е по-евтина от други търговски микробни и животински липази (Kartal et al., 2009; Li et al., 2009; Mendes et al., 2012). Разследваният PPL се състои от една верига от 449 вида аминокиселини и 7 вида дисулфидни връзки (Giessauf and Gamse, 2000; Mendes et al., 2012). PPL вече е бил използван като биокатализатор за енантиоселективна естерификация на глицидол (Martins et al., 1994) и ензимна хидролиза на триолеин, както и неговите частични глицериди (Glowacz et al., 1996). В това проучване PPL е избран като катализатор, който може да се използва за разграждане на патулин.

Засега има малко изследвания за прякото ензимно разграждане на патулина. Целта на тази работа беше да се изследва разграждането на патулина с помощта на PPL, който може да осигури вид материал за разграждане на патулина в плодове и зеленчуци. И целта на това изследване, докладвано тук, беше да изследва скоростта на разграждане на PPL за патулин при различни условия и да характеризира механизма на действие чрез сканиране с пълна дължина на вълната и анализ на масспектрометрия.

Материали и методи

Материали

PPL (тип II, E.C. 3.1.1.3, със специфична активност от 100–400 единици зехтин на милиграм протеин) се доставя от Sigma-Aldrich, Co., Ltd. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ); оцетната киселина е с аналитична чистота и се използва, както е получена, без допълнително пречистване. Ацетонитрил и хлороформ са с високоефективна течна хроматография. Патулин е получен от Sigma-Aldrich, Co., Ltd. Ултрачиста вода се използва през всички експерименти.

Приготвяне на разтвор на патулин

Работно решение A

Твърдият патулин се разтваря в 50 ml хлороформ, за да се получи 100 mg/L стандартен разтвор на патулин, и се съхранява при –18 ° C. Стандартният разтвор на патулин може да се изпари, за да изсъхне, след това да се разтвори в дейонизирана вода (коригирано до рН 4,0 с оцетна киселина) с крайна концентрация 5 mg/L (Zhang et al., 2016). Получава се работният разтвор А.

Работно решение Б

The Penicillium expansum щам М1 е получен от нашата лаборатория. Щамове М1 се култивират при 28 ° С в продължение на 14 дни в PDA среда. Процесът на екстракция на патулин се приготвя съгласно методологията, описана от MacDonald et al. (2000) с някои модификации: сместа от гъбички и хранителна среда се отделя, последвано от екстрахиране три пъти с етилацетат, почистване чрез екстракция с 10 ml 1,5% (w/v) воден разтвор на натриев бикарбонат. Етилацетатният екстракт се прекарва през шейкър-инкубатор със 180 r/min, 25 ° С за 1 h и се изпарява до сухо. След това патулинът се разтваря в 1 ml дейонизирана вода, регулирана до рН 4.0 с оцетна киселина. По този начин се получава работното решение В.

Разграждане на патулин от PPL

Експериментите за разграждане на патулин във воден разтвор се провеждат в 50 ml колби на Erlenmeyer. Прахообразният PPL се добавя непрекъснато към 5 ml работен разтвор В. Контролата се приготвя без добавяне на PPL (Guo et al., 2013). Те бяха поставени върху шейкър-инкубатор със 180 r/min, 30 ° C. Концентрацията на патулин във воден разтвор след разграждането може да бъде измерена чрез HPLC. След това 0,45 μm microPES (Shimadzu, Япония) се използва за пречистване преди откриване (Peng et al., 2016). Пробите бяха открити чрез HPLC с UV детекция (Li et al., 2007).

Ефектът на количествата липаза върху скоростта на разграждане е изследван в диапазона от 0,3–2,4 mg. Ефектът на рН се изследва при рН от 3,5 до 8,5. Стойността на рН се регулира до желания 1 mol/L фосфатен буферен разтвор. Изследван е ефектът на температурата върху скоростта на разграждане в диапазона от 20 до 60 ° C. Ефектът от времето за контакт се провежда на девет различни нива на всеки 6 часа в продължение на 54 часа. Ефектът от първоначалната концентрация на патулин се провежда в диапазона 5–30 mg/L.

Степента на разграждане на PPL за патулин беше изчислена с помощта на уравнение. (1):

където, ω (%) е степента на разграждане на PPL за патулин; С0 и Ce (mg/L) са съответно началната и равновесната концентрация на патулин в разтворите.

Капацитетът на разграждане на PPL за патулин беше изчислен с помощта на уравнение. (2).

където, qe (mg/mg) е способността за разграждане на PPL за патулин; С0 и Ce (mg/L) са съответно началната и равновесната концентрация на патулин в разтворите. V (ml) е обемът на водните разтвори на патулин и м (mg) е масата на сухия PPL.

Ултрафилтрация и определяне

Центробежните концентратори Vivaspin с молекулно тегло от 3000 са получени от Millipore (Bedford, MA, САЩ). Пробите бяха прехвърлени в центробежни филтри Vivaspin, въртяни при 4000 × ж в люлеещ се ротор на кофа при 25 ° C за 10 минути, за да се изчерпят протеините с високо молекулно тегло. Накрая бяха събрани 1 ml разграждане на патулин (Zheng et al., 2006).

След това се използва 1260 HPLC система (Agilent, САЩ), оборудвана с UV детектор за откриване на концентрацията на патулин. Аналитичната колона беше Agilent ZORBAX SB-C18, 5 μm × 4.6 mm × 250 mm; не е използвана охранителна колона. Подвижната фаза, елуираща се със скорост на потока от 1 mL/min, се състои от изократична смес от ацетонитрил/вода (1: 9, v: v). Хроматограмите за изчисления бяха извлечени при 276 nm. HPLC колоната беше кондиционирана преди анализ чрез пускане на фон без инжекция. За редовен анализ се инжектират 20 μL проба или стандартен разтвор. В допълнение към пробите и стандартите за калибриране бяха анализирани контролни проби за всяка матрица. Изискванията за възстановяване на тези проби бяха определени на 60–115%. Границите на откриване и количествено определяне бяха съответно 10,78 и 32,67 μg/L (Li et al., 2015).

Идентифициране на продуктите от разграждането

Прахообразният PPL се добавя към 5 ml работен разтвор А постоянно.

Оптичните спектри на пробите са записани с помощта на UV-Visible спектрофотометър Unico UV2102-PC (Шанхай, Китай) (Zhu et al., 2016). Пробите за 24 часа бяха прехвърлени в центробежни филтри Vivaspin, въртяни при 4000 × ж за 10 минути за изчерпване на PPL. Накрая бяха събрани 1 ml продукт за разграждане на патулин. Приготвянето на патулинови разтвори се разрежда с ултрачиста вода. И UV-vis спектрите бяха записани от 190 до 700 nm.

Използвана е точна маса Q-TOF LC/MS (Agilent, САЩ). Молекулното тегло на продуктите от разграждането на патулин беше определено чрез ESI-MS. Подвижната фаза, елуирана със скорост на потока от 0,4 ml/min, се състои от изократична смес от метанол/вода (1: 9, v: v). Обемът на инжектиране на пробата е 20 μL. ESI-MS експерименти бяха проведени в режим на положителна йонизация. Параметрите на работа на MS бяха зададени, както следва: капилярно напрежение 4000 V, поток на изсушаващия газ 10 L/min, температура на изсушаващия газ 350 ° C, температура на изпарителя 450 ° C и налягане на пулверизатора 40 psi. Оптималното напрежение на фрагментатора е 50 V, с масов диапазон m/z 20–500 за режими на сканиране MS/MS, съдържащи сканиране на продукти и прекурсорни йони. За събиране и анализ на данни е използван софтуерният пакет Agilent Mass Hunter (версия 6.1) (Agilent, САЩ).

Статистически анализи

Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра и резултатите бяха изразени като средно ± стандартно отклонение. Данните бяха анализирани чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), използвайки SPSS (версия 19.0, SPSS, Inc.) и бяха приети множество сравнения на Дънкан за оценка на статистическата значимост (P + адукти C7H6NaO4 (M + Na) + изчислено: 177.0158, ESI-MS установено: 176.9852. И патулинът беше идентифициран при m/z = 155.0054 за протониран катион [М + Н] +. MS на патулин след разграждане (Фигура 8В) показва, че патулинът в пробите, третирани с PPL, е много по-малък от необработените. Молекулното тегло на продукта може да бъде 159.0558, в съответствие с молекулното тегло 159.0594 за C7H11O4 + (Фигура 9). Това показва, че патулинът реагира с реакция на отваряне на пръстена с PPL. Фрагментът при m/z 159 алтернативно може да претърпи последователни загуби на въглероден диоксид (Malysheva et al., 2012). Спекулацията съответства на предишното проучване чрез UV сканиране. Предполага се, че патулинът вероятно се метаболизира до разграждащ се продукт, който е химически различен от патулина.

ФИГУРА 8. MS/MS преди (А) и след (Б) Деградация на PPL.