Молекулярна и клетъчна онкология

Тази статия е част от изследователската тема

Протеомика и нейните приложения при рак Вижте всички 22 статии

Редактиран от
Суман С. Тхакур

Център за клетъчна и молекулярна биология (CCMB), Индия

Прегледан от
Даниеле Вергара

Университет в Саленто, Италия

Алесандро Карер

Институт по молекулярна медицина Венето (VIMM), Италия

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

модел

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Училище за следдипломно обучение, CES University, Меделин, Колумбия
  • 2 Основна научноизследователска група, Медицинско училище, Университет CES, Меделин, Колумбия
  • 3 Доцент, катедра по патология, Университет на Антиокия, Меделин, Колумбия
  • 4 Колумбийски институт по тропическа медицина (ICMT), Сабанета, Колумбия
  • 5 Отделение по хепатобилиарна и панкреатична хирургия, клиника CES, Меделин, Колумбия

Предназначение: Да се ​​анализират човешки и бактериални протеомни профили в жлъчката, изложени на тумор спрямо не-туморна микросреда, за да се идентифицират разликите между тези състояния, които могат да допринесат за по-доброто разбиране на канцерогенезата на панкреаса.

Пациенти и методи: Използвайки течна хроматография и масспектрометрия, човешки и бактериални протеомни профили на общо 20 проби от жлъчка (7 от пациенти с жлъчен камък (GS) и 13 от пациенти с дуктален аденокарцином на главата на панкреаса (PDAC)), които бяха събрани по време на операцията и взети директно от жлъчния мехур, са сравнени. g: Profiler и KEGG (Киото енциклопедия на гени и геноми) Mapper Reconstruct Pathway бяха използвани като основна сравнителна платформа, фокусираща се върху свръхпредставените биологични пътища сред човешките протеини и пътищата на взаимодействие между бактериалните протеини.

Резултати: Три пътища на бактериална инфекция бяха свръхпредставени в човешката PDAC група протеини. IL-8 е единственият човешки протеин, който съвпада по трите пътища и този протеин присъства само в групата PDAC. Количествените и качествени разлики в бактериалните протеини предполагат дисбиотична микросреда в групата PDAC, подкрепена от значително участие на антибиотични ензими за биосинтеза. Сигналните пътища за взаимодействие на прокариотите подчертават присъствието на зеатин в GS групата и сурфактин в PDAC групата, първият в метаболизма на терпеноиди и поликетиди, а вторият и в двата метаболизма на терпеноиди, поликетиди и чувствителност на кворума. Въз основа на нашите констатации, ние предлагаме бактериално индуциран модел на канцерогенеза за жлъчните пътища.

Заключение: Доколкото ни е известно, това е първото проучване с цел сравняване на човешки и бактериални жлъчни протеини в тумор срещу нетуморна микросреда. Предложихме нов модел на канцерогенеза за жлъчните пътища, базиран на метапротеомични находки на жлъчката. Нашите резултати показват, че бактериите могат да бъдат ключови играчи в канцерогенезата на жлъчните пътища, в дълготрайна дисбиотична и епителиално вредна микросреда, в която формирането на биофилми на специфични бактериални видове е от първостепенно значение. Нашата констатация трябва да бъде проучена допълнително при бъдещо използване инвитро и in vivo разследвания.

Въведение

Бактериите са свързани с доброкачествени и злокачествени заболявания, а бактериалната канцерогенеза е процес, който все още се характеризира подробно. Познанията от такова проучване могат да бъдат отправна точка за стимулиране на клинични интервенции, насочени към профилактика на рака. Канцерогенезата, свързана с вируси, се основава на интеграцията на вирусния геном в ДНК на гостоприемника (т.е. човешки папиломен вирус, Epstein-Barr) и е широко проучена и характеризирана (10). И обратно, бактериалната канцерогенеза е феномен, за който се смята, че е резултат от хроничното излагане на епителните клетки на провъзпалителна среда, изострена от бактерии (11, 12). Този провъзпалителен, физиопатологичен механизъм обаче не може да обясни убедително сам по себе си развитието на карциноми в стомашно-чревния и жлъчния тракт, тъй като възпалителните явления се появяват редовно през целия човешки живот и само няколко човека развиват злокачествени новообразувания.

Жлъчката се съхранява и концентрира в жлъчния мехур, който е чист резервоар, където тази биологична течност може да бъде извлечена за анализ на протеини (24). При изследвания обикновено се вземат проби от жлъчката от дисталната част на жлъчните пътища по време на ендоскопски интервенции, като ендоскопска ретроградна холангиопанкреатография (ERCP) (25). Въпреки това, възпалителният процес, свързан с жлъчна обструкция при повечето пациенти с PDAC, може да промени състава на жлъчните протеини в дисталната част на жлъчните пътища и да ограничи намирането на значима биологична информация. Липсата на значими биологични открития възпрепятства разработването на специфичен модел на канцерогенеза за жлъчните пътища, който отчита неговите уникални физиологични условия и взаимодействието на човешки и бактериални протеини.

Материали и методи

Етика и вземане на проби

Екстракция на протеини

Пробите от жлъчката се размразяват при стайна температура и се обработват, както е описано по-рано с леки модификации (29). Накратко, 1 ml жлъчка се центрофугира в продължение на 10 минути при 4 ° C и 3000 rpm и се добавят 1 ml TRI реагент и 1 ml хлороформ. Сместа се инкубира в продължение на 5 минути при стайна температура (20–25 ° C) и се центрофугира в продължение на 15 минути при 4 ° C и 12 000 х g за отделяне на протеини. Избягвайки централния липиден слой, останалото съдържание на епруветката (супернатант + пелети) се прехвърля в нова епруветка. След това се добавят 1200 μL ацетон, смесват се, инкубират се в продължение на 4 часа и се центрофугират в продължение на 15 минути при 4 ° С при 12 000 х g. Ацетонът се изхвърля и епруветките се сушат при стайна температура, след което към гранулата се добавят 200 μL възстановяващ буфер и разтворът се изсушава и лиофилизира.

Протеомични анализи

Протеомичният анализ беше извършен от Creative Proteomics (Ramsey Road, Shirley, NY 11967, USA), накратко използваните техники са описани както следва:

Подготовка на пробата за протеомен анализ

Общите протеини се утаяват от протеиновия разтвор, използвайки метанол и хлороформ. Приблизително 10 μg от общия протеин се разтваря в 6 M воден разтвор на урея и се денатурира с 10 mM DL-дитиотреитол, инкубира се при 56 ° С за 1 h, последвано от алкилиране с 50 mM йодоацетамид и се инкубира в продължение на 60 min при стайна температура, защитен от светлина. След това към разтвора се добавят 500 mM амониев бикарбонат (ABC), за да се получи крайна концентрация от 50 mM ABC с рН 7,8. Промега трипсин се добавя към протеиновия разтвор за храносмилане при 37 ° С в продължение на 15 часа. Генерираните пептиди се пречистват допълнително с колона C18 SPE (Thermo Scientific) за отстраняване на солта. Пробите се сушат във вакуфуга и се съхраняват при -20 ° C до употреба.

Нано течна хроматография

Easy-nLC1000 (ThermoFisher Scientific, САЩ), свързан към 100 μm × 10 cm вътрешно направена колона, снабдена със смола ReproSil-Pur C18-AQ с обърната фаза (3 μm, 120 Å, Dr. Maisch GmbH, Германия) беше използван. Зарежда се обем от проба от 5 μL с общ дебит 600 nL/min и подвижна фаза от A: 0,1% мравчена киселина във вода; и В: 0,1% мравчена киселина в ацетонитрил. Аналитичното разделяне се провежда, използвайки градиент: от 6 до 9% В за 15 минути, от 9 до 14% В за 20 минути, от 14 до 30% В за 60 минути, от 30 до 40% В за 15 минути и от 40 до 95% В за 3 минути, елуиране с 95% В за 7 минути.

Масова спектрометрия и анализ на данни

Използван е масспектрометър Orbitrap Q Exactive ™ (Thermo Fisher Scientific, САЩ), настроен на напрежение на разпръскване от 2.2 kV и капилярна температура от 270 ° C. Разделителната способност на масовата спектрометрия беше зададена на 70 000 при 400 m/z, а обхватът на m/z на предшественика: между 300,0 и 1800,0. Обхватът на производственото сканиране започва от m/z 100, активиран от индуцирана от сблъсък дисоциация (CID) и широчина на изолация от 3,00. Суровите файлове бяха анализирани и търсени спрямо базата данни за човешки протеин от Uniprot, използвайки Maxquant (1.5.6.5). Параметрите бяха определени, както следва: модификациите на протеините бяха карбамидометилиране (С) (фиксирано), окисление (М) (променливо); ензимната специфичност е настроена на трипсин; максимално пропуснатите разцепвания бяха определени на 2; толерансът на масата на прекурсора на йони беше зададен на 10 ppm, а MS/MS толерансът беше 0.6 Da.

Избор на списък на човешки и бактерии пептид-протеин за анализ

Анализът на пептид-протеин е извършен в университета ICMT-CES. Замърсителите, албуминът, свързаните с хемоглобина пептиди и пептидите с нулева интензивност бяха елиминирани от пълния списък с човешки и бактериални пептиди-протеини. Идентификаторите на протеина бяха стандартизирани, липсващите имена на гени бяха попълнени ръчно и бе проверена таксономията на протеините.

След това пълният списък на споделените протеини беше адаптиран, за да отговори на изискванията на онлайн версията 1.18.1 (30) на платформата Prostar, търсейки диференциално богати човешки и бактериални протеини сред групите (GS срещу PDAC). Стойностите на интензитета бяха нормализирани със средния метод на центриране, без да се включва намаляване на дисперсията. Частично наблюдаваните стойности бяха вменени с помощта на метода SLSA (Structured Least Squares Adaptive). Тестът за хипотеза е извършен с помощта на теста на Student т-тест, като се има предвид логаритмична промяна от 2,5 и коригиране на процента на фалшивото откриване до 0,42% (стр-стойност = 0,00316). Изследвана е биологичната валидност на определяне на несъществуващи стойности за не-наблюдавани протеини, за да се сравнят изключителните групи протеини. Ние обаче избрахме да извършим анализа въз основа само на наблюдаваните стойности в двете групи, GS и PDAC (споделени протеини).

За по-нататъшен качествен анализ, всички списъци с човешки протеини на общите, ексклузивни и диференциално богати протеини от пациенти с GS и PDAC (Фигура 1) бяха включени в модула за извличане на ID/картографиране на ресурса на консорциума Universal Protein (Uniprot http: // www .uniprot.org /, издание на UniProt 2019_10). След това, за да се предоставят механистични прозрения за биологично интегрираната функция, стандартизирани от Uniprot човешки протеинови списъци на записи за всяка група бяха анализирани в уеб страницата g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost ) (26). g: Profiler позволява подход с множество заявки, който извършва прекалено представителен функционален анализ на множество списъци с протеинови гени, сравнявайки протеините между групите. Опциите по подразбиране бяха запазени в g: Profiler, без добавяне на анотации на електронна генна онтология и корекция на Bonferroni за множество корекции на теста. Значителни, коригирани, прекалено представени пътища (стр-стойности Ключови думи: рак на панкреаса, метапротеомичен, протеомен, жлъчка, зеатин, сурфактин, IL-8, модел на канцерогенеза

Цитиране: Arteta AA, Sánchez-Jiménez M, Dávila DF, Palacios OG и Cardona-Castro N (2020) Модел за канцерогенеза на жлъчните пътища, базиран на метапротеомика на жлъчката. Отпред. Онкол. 10: 1032. doi: 10.3389/fonc.2020.01032

Получено: 05 февруари 2020 г .; Приет: 26 май 2020 г .;
Публикувано: 24 юли 2020 г.

Suman S. Thakur, Център за клетъчна и молекулярна биология (CCMB), Индия

Алесандро Карер, Институт по молекулярна медицина Венето (VIMM), Италия
Даниеле Вергара, Университет в Саленто, Италия