Ануп Кумар

Национален институт по биология, Ноида, Индия

Маной Кумар Раджпут

Национален институт по биология, Ноида, Индия

Deepika Paliwal

Национален институт по биология, Ноида, Индия

Aakanksha Yadav

Национален институт по биология, Ноида, Индия

Реба Чхабра

Национален институт по биология, Ноида, Индия

Surinder Singh

Национален институт по биология, Ноида, Индия

Резюме

Въведение

Инфекцията с вируса на хепатит С (HCV) се очертава като едно от основните здравни предизвикателства с около 200 милиона заразени с HCV хора, които покриват около 3,3% от световното население и са отговорни за около 350 000 смъртни случая годишно 1, 2. HCV инфекцията е инфекция, пренасяна с кръв, която главно причинява чернодробна фиброза, която прогресира в чернодробна цироза и рак на черния дроб 3. Регионите с ниски ресурси като Индия, Източна Азия, Северна Африка и Близкия изток допринасят за 80% от глобалната тежест на HCV инфекцията 4. Около девет процента от населението, заразено с HCV в света, живее в Индия и представлява голям дял от хора, заразени с HCV (

HCV може да бъде открит чрез серологични тестове, използващи анти-HCV антитела и молекулярни тестове, използващи молекулярни сонди, допълващи HCV RNA последователност 17. Съгласно Закона за наркотиците и козметиката, 1940 и 1945 г. и правилата съгласно него, скринингът на кръвни единици с трето поколение серологични анализи е задължителен в Индия 18. Предлагат се серологични анализи от четвърто поколение с по-висока чувствителност, които твърдят, че намаляват периода на прозореца. Молекулярните тестове не само помагат в ранната диагноза, но също така потвърждават стадия на инфекцията. Диагнозата и количественото определяне на HCV с високо чувствителен и специфичен метод играят решаваща роля при лечението на HCV инфекция. Съобщава се, че различните генотипове на HCV реагират различно на анти-HCV терапия 19. Тези генотипове се различават един от друг на своите геномни нива. HCV е склонен към транскрипционни вариации по време на процеса на репликация на своя геном. В допълнение, геномът на HCV непрекъснато се развива поради глобализацията. Този преглед обобщава информация за методите за молекулярна диагностика на HCV и техните приложения, използвани в различни части на света.

Организация и функция на генома на HCV

генотипиране

Схематично представяне на геномната организация на вируса на хепатит С. Целият геном кодира полипротеин, който по-нататък се преработва в три структурни [ядро (С), обгръщащ протеин (Е1 и Е2)] и пет неструктурни протеина [NS1, NS2, NS3, NS4 и NS5]; Позициите на протеини са показани с цифри в горната част на схемата. Фигурата е модифицирана и възпроизведена с разрешение от Ref 20.

Естествена история на вируса на хепатит С

Разбирането на персистентността на вируса и начините на предаване е важно за предотвратяване на HCV инфекция. HCV обикновено се предава чрез преливане на заразена кръв, незащитена високорискова сексуална активност, трансплантация на органи от заразени донори и майки на плода. С прилагането на подобрени скринингови методи се наблюдава намаляване на предаването на HCV от 0,0002 на 0,00005% в развитите страни 41, 42, 43 .

HCV генотипове, подтипове и анти-HCV терапия

Както бе споменато по-рано, HCV щамовете са класифицирани в седем генотипа въз основа на филогенетичните и последователни анализи на HCV геноми, а във всеки генотип HCV допълнително е класифициран в 67 подтипа 46. В Индия генотип 3 е преобладаващият генотип (

63,85%), последван от генотип 1 (25,72%). HCV генотип 3 е по-разпространен в северните, източните и западните части на Индия, а генотип 1 е по-разпространен в южната част на Индия 47. Въпреки широкото разпространение на генотипове 3 и 1, в някои региони на страната също има повишено разпространение на генотипове 4 и 6. Генотип 4 се среща най-вече при пациенти от Южна Индия от щатите Андра Прадеш и Тамил Наду. Установено е, че генотип 6 е преобладаващ при пациенти, принадлежащи към североизточните части на Индия 48. Наблюдава се и повишено разпространение на генотип 6 в различни части на съседната държава Мианмар, която споделя границите си със североизточните щати на Индия 49. Генотип 2 се съобщава рядко, докато генотип 5 все още не е докладван от Индия 47 .

С напредването на медицинските изследвания и клиничните изпитвания на нови лекарства, лечението на HCV инфекция е изместено от пегилиран интерферон/рибавирин към комбинирани терапии с директно действие антивирусни (DAA). Тези DAA насочват и инхибират ключови етапи от пътя на репликация на HCV. DDAs са класифицирани в четири класа въз основа на техния механизъм на действие и цел 50 (Таблица).

Таблица

Класове на директно действащи антивирусни средства (DDA), одобрени/в клинични изпитвания

Методи за генотипиране на HCV

Генотипът на HCV за диагностика се определя най-вече чрез секвениране на геномна нуклеотидна последователност или чрез базирани на китове анализи, които използват допълнителни сонди за докладване на генотип, присъстващ в образец. Секвенирането на силно запазени региони като NS5, ядро, E1 и 5’UTR е най-препоръчаният метод, използван за генотипиране на HCV 61. Базовите анализи са лесни за използване и не изискват опит, както е необходимо за секвениране. Както TruGene 5’NC HCV Genotyping kit (Siemens Healthcare Diagnostics Division, Tarrytown, NY), така и Versant ™ HCV Genotype Assay LiPA (версия I, Siemens Medical Solutions, Diagnostics Division, Fernwald, Германия) са базирани на 5’UTR последователност. И двата комплекта използват обратна хибридизация със специфични за генотипа олигонуклеотидни сонди 62. И двата комплекта твърдят, че откриват HCV генотипове 1 до 6. Abbott RealTime HCV Genotype II Kit твърдят, че откриват генотип 1 до 5. HCV генотип комплект cobas® HCV GT, произведен от Roche, твърди, че идентифицира HCV генотипове 1-6 и може да прави разлика между подтип а и b на генотип-1. Напълно автоматизирана система cobas® 4800 (Roche, САЩ) също е пусната за генотипиране на HCV. Допълнителните сонди срещу три области, 5’UTR, Core и NS5B на генома на HCV са включени за точност на генотипирането и подтипирането.

Duarte et al 63 разработиха xMAP Luminex система за анализ, течен метод за генотипиране на HCV, базиран на микрочипове. Допълнителните последователности срещу най-променливия регион NS5B и силно запазения 5’UTR бяха използвани за определяне на HCV генотипове. Показаните резултати са в 100-процентно съответствие с Versant ™ HCV Genotype Assay LiPA. Разработени са и два високопроизводителни метода, като LightCycler® системи, базирани на анализ на кривата на разтопяване 64, 65 и използващи технология за полезно лазерно десорбционно йонизационно време на полет (MALDI-TOF) 66. Athar et al 67 разработиха анализ, базиран на полимеразна верижна реакция (PCR) в реално време, използвайки две двойно маркирани самозаглушени сонди от основната област на генома на HCV. Те използваха специфичните сонди на ядрената област на HCV и точните генотипове на HCV могат да бъдат определени чрез криви на топене от съответните сонди в RT PCR 67 .

Други алтернативни методи за генотипиране на HCV са амплификация със специфични за типа праймери или специфични за типа сонди 68, 69, анализ на полиморфизма с дължина на рестрикционния фрагмент (RFLP) 70, тестване на линейна сонда 71 и анализ на мобилността на хетеродуплекс 72, 73 .

Диагностични методи за HCV

HCV инфекцията може да бъде открита чрез серологични методи и молекулярни методи (фиг. 2) 74. Точната диагноза на HCV инфекцията е важна преди започване на терапията. Диагнозата, за да се знае стадият на HCV инфекцията, също е от решаващо значение, тъй като HCV инфекцията се изчиства в рамките на 6-12 месеца при 15-45% от заразените индивиди и тези индивиди остават положителни срещу HCV антитела, без да се открива виремия. В такива случаи лекарите трябва да правят разлика между заразените и възстановените лица 75. По-рано серологичната реактивност на HCV инфекция чрез ELISA е потвърдена чрез рекомбинантен имуноблот анализ (RIBA). RIBA е прекратена като потвърждаващ метод за диагностика на HCV инфекция. Понастоящем тестването на нуклеинови киселини (NAT) се счита за златен стандарт за потвърждаване на активна HCV инфекция 76. NAT се основава на откриването на HCV РНК или HCV геном в образец.

Алгоритъм за тестване на вируса на хепатит С. Откриването на HCV антитяло (Ab) се извършва чрез лабораторен анализ. По-нататъшното тестване на HCV Ab положителни проби ще покаже или настояща или минала HCV инфекция, или фалшива положителност на HCV антитела. Положителните проби трябва да бъдат тествани чрез тестване на базата на нуклеинова киселина (NAT), тъй като положителният показва текущата HCV инфекция, а отрицателният показва или минала или разрешена HCV инфекция, или фалшива Ab положителност. Модифициран и възпроизведен от Ref 71.

Серологични тестове за диагностика на HCV

HCV може да се диагностицира чрез откриване на анти-HCV антитяло в серумни или плазмени проби, където нереактивен резултат се счита за отсъствие на HCV инфекция. Освен това, за да се обяви HCV инфекция за активна инфекция, тя трябва да бъде потвърдена чрез тест за HCV РНК. Анализите, използвани за откриване на HCV инфекция, са разработени, за да минимизират броя на фалшивите положителни резултати с подобряване на тяхната специфичност. Последователните поколения на HCV серологични тестове не само са подобрили чувствителността и специфичността, но също така са намалили периода на откриване на инфекция 77, 78, 79 .

Анализ от първо поколение: Те се основават на свързване на анти-HCV антитяло и рекомбинантен протеин, съдържащ NS4 (C100-3) епитопична област. Тези анализи биха могли да идентифицират около 80% анти-HCV IgG в случаи след трансфузия; следователно тяхната чувствителност и специфичност бяха много ниски 80. Съобщава се, че процентът им на фалшива позитивност при популации с нисък риск достига 60%.

Анализи от второ поколение: Рекомбинантните протеини от сърцевина (структурни), NS3 и NS4 бяха използвани като свързващи протеини с анти-HCV антитяло. Съобщава се, че тези анализи имат по-добра чувствителност и специфичност. Анализите от второ поколение намаляват периода на HCV на прозореца до 10-24 седмици 79 .

Анализи от трето поколение: Имуносорбентът съдържа рекомбинантни протеини на ядро, NS3, NS4 и NS5 области. Специфичността на диагнозата над 99% е докладвана за тази категория анализи 81. Анализите от трето поколение могат да покажат фалшиво отрицателни резултати при пациенти, които са имунокомпрометирани или са подложени на хемодиализа 62. В Индия, съгласно Закона за наркотиците и козметиката, 1940 и 1945 г., използването на серологични тестове от трето поколение е задължително за скрининг на донорски единици за наличие на HCV инфекция преди трансфузия 67 .

Анализи от четвърто поколение: Анализите от четвърто поколение са известни също като „антиген-антитяло комбинирани тестове“, тъй като принципът на тези анализи се основава на откриването едновременно на анти-HCV антитяло и HCV антиген. Тези анализи са силно чувствителни и са отговорни за високото намаляване на периода на прозореца. Средният период на прозореца е 26,8 дни за тези анализи 79 .

По-рано, според CDC, човекът, който има положителен серологичен тест, трябва да бъде потвърден от RIBA за HCV инфекция, но сега тестването на HCV RNA за нуклеинова киселина се използва за потвърждаване на активна HCV инфекция 76 .

Рекомбинантни имуноблот анализи (RIBA)

RIBA по-рано се използва за потвърждаване на HCV инфекцията и се основава на откриването на анти-HCV антитяло чрез имобилизиран HCV антиген и синтетичен пептид от структурни (ядро) и неструктурни (NS3 и NS5) протеини като отделни ленти върху мембрана. Появата на поне две ленти се счита за индикатор за потвърдена инфекция, а появата на единична лента се счита за неопределен резултат. Неопределените случаи се дължат на неспецифични кръстосано реагиращи антитела или широкият хуморален отговор не е предизвикан от скорошната инфекция. Като цяло резултатите от заразени с HCV индивиди на възраст са докладвани като неопределени, които могат да бъдат превърнати в потвърдени случаи след 1-6 месеца инфекция 82 .

Бързи анализи

Бързите тестове са конфигурирани да генерират резултати в рамките на половин час и могат да бъдат използвани за тестване на точката на грижа. Тези анализи не изискват сложен инструмент и високо обучен персонал. Три бързи теста (Orasure, Chembio и Medmira) за анти-HCV IgG са оценени от CDC в лаборатория, както и в полеви настройки. Специфичността и чувствителността на тези тестове бяха> 99% и 86-99%, съответно 83. Основният недостатък на серологичните анализи е тяхната неспособност да различават активна и неактивна инфекция. Тестовете за серологични анализи са положителни поради наличието на анти-HCV IgG дори след изчистването на виремичните частици от имунната система. Другият недостатък на тези анализи е периодът на голям прозорец. През този период HCV РНК е първият откриваем диагностичен маркер и е последван от диагностичен маркер на основния антиген. Генерирането на анти-HCV антитяло е последвано от тези два диагностични маркера. Поради този недостатък, кръвната банка в САЩ прие тестване на основата на нуклеинова киселина (NAT) като златен стандартен метод за диагностика на HCV в края на 90-те години 84 и поради прилагането на NAT, свързаният с трансфузия риск от HCV инфекция беше намален до 0,0001% в САЩ 6 .

Тестване на нуклеинова киселина (NAT)

NAT е молекулярна техника и се основава на усилване и откриване на вирусна нуклеинова киселина. NAT намалява риска от трансфузионно предавани инфекции (TTI); следователно, той добавя допълнителен слой на безопасност към кръвта, който да се използва за преливане. Два вида технологии, PCR и транскрипционно медиирана амплификация (TMA) се използват рутинно за NAT тестване на кръводаряване за HCV инфекция. Основното предимство на теста за нуклеинова киселина е ранното откриване на HCV инфекция. HCV РНК в заразени проби може да бъде открита в рамките на една седмица след първоначалната експозиция 19. Поради високата чувствителност и специфичност NAT се използва за разделяне на проби, които се отчитат като неопределени и или фалшиво отрицателни чрез серологични методи 85 .

В международно проучване за NAT тестване на около 300 милиона кръводарения за HIV и HCV и около 100 милиона дарения за HBV инфекция в 37 страни, Roth et al 86 отчитат 3000 NAT добива. Тези кръводарявания са докладвани като нереактивни чрез серологични скринингови методи 86 .

Опит за кръвен скрининг на NAT в страни с ниски ресурси

Осъзнавайки необходимостта и ползите от NAT тестването, страните с ниски ресурси също прилагат NAT тестове на национално или централно ниво за скрининг на кръводаряване. През 2007 г. в тайландския кръвен център бяха извършени скрининг на 486 676 серонегативни кръводарявания от NAT. Степента на добив на NAT за HIV-1, HCV и HBV е била 1: 97 000, 1: 490 000 и 1: 2800, съответно 87. В Северна Индия в кръвна банка бяха изследвани 73 898 кръводарения за HIV, HBV и HCV чрез ELISA и индивидуален тест за амплификация на донор-нуклеинова киселина (ID-NAT). От всички дарения, 1104 (1,49%) дарения са установени за положителни от мултиплекс NAT. Освен това при NAT тестване са докладвани 37 HCV, 73 HBV, един HIV и 10 HBV-HCV коинфектирани случая, които не са реагирали чрез ELISA тестване 88. В Индия различни групи в различни центрове съобщават за различни нива на NAT добив за HCV инфекция. Добивът на NAT, докладван от Agarwal et al 88, е 1 на 610. Kumar et al 89 отчитат 1 на 753, а Mangwana и Bedi 90 като 1 на 974. В Бразилия до юли 2005 г. 139 678 дарения са били проверени в басейни от 6 до 12 дарения от вътрешен RT-PCR метод с чувствителност 500 IU/ml за всичките шест генотипа на HCV. От 139 678 дарения за 315 (0,23%) е установено, че са положителни за HCV РНК 91 .

Тестването на NAT може да се извърши за индивидуални дарения (ID-NAT) или минни пулове (MP-NAT). Мини-басейн може да бъде изготвен чрез обединяване на 6, 8, 16 или 24 индивидуални дарения. Въпреки че NAT е много полезен поради изискването за по-големи инвестиции за прилагането му, страните с ниски ресурси като Индия не могат да го направят задължително за скрининг на кръв за TTI. За да направят скрининга на кръв рентабилен, различни окръзи и институции използват мини-пулове от 6, 8, 16 и 24. В Германия, след въвеждането на MP-NAT през 1997 г., 23 HCV, 2 HIV-1 и 43 HBV-заразени кръводаряване е открито при около 31 милиона кръводарения 92. Въз основа на анализа на данните на NAT, Mathur и сътр. 93 показаха, че NAT може да стане рентабилен чрез метод на обединяване (мини-пулове) в Индия. Има някои недостатъци на мини-пуловете при NAT тестване; първо, разреждането на броя на вирусното копие намалява чувствителността. Второ, ако даден пул бъде реактивен, всички обединени дарения трябва да бъдат тествани за идентифициране на индивидуалното положително дарение. Следователно, за да се преодолеят тези ограничения, се предлага ID-NAT тестване.

Тестването на HCV инфекция чрез NAT за нейното РНК откриване се извършва чрез PCR или TMA или разклонено усилване на сигнала на дезоксирибонуклеинова киселина (bDNA). В NAT технологията за тестване на HCV се използва високо консервиран 5 ’UTR на генома на HCV като целева последователност за неговото откриване 94. Този регион е запазен сред всички генотипове на HCV; следователно праймерите са проектирани да хибридизират с възможно най-малко несъответствия между шест различни генома на HCV. Повечето производители на NAT тестови комплекти са разработили своите анализи, съвместими само с тяхното оборудване. Всички видове платформи, ръчни, полуавтоматизирани и напълно автоматизирани са на разположение за тестване на HCV NAT. В изследователските лаборатории качественият HCV-NAT се използва за диагностика с помощта на конвенционален RT-PCR, но диагностичните лаборатории започнаха да използват комплекти за диагностика на HCV.

Качественият NAT е използван за скрининг на HCV инфекция по време на кръводаряване и за потвърждаване на виремия при пациенти 95. Долната граница на откриване от ≤50 IU/ml се заявява от различни производители за техните качествени молекулярни методи. От друга страна, определянето на вирусно натоварване на прогнозата на HCV заболяването може да се извърши чрез количествена технология RT-PCR и bDNA.

Разпространението на HCV в Индия е по-високо в сравнение със Западна Европа и САЩ 96. Разпространението на HCV, съобщено от различни групи в индийското население, е 1 на 4138 90, 1 през 1997 г. 88 и 1 на 2536 89 .

Въпреки че NAT намалява риска от TTIs като HCV в индийския контекст, има някои ограничения за неговото задължително прилагане. В Индия използването на NAT в редовните практики е ограничено поради високите разходи, техническото търсене като обучена работна сила или консумативи за оборудване 97. През 2014 г. Chandrashekar 98 разработи вътрешен анализ за безопасност на кръвта с минимални разходи. Този анализ беше счетено за възможно да се приложи в малка единица за молекулярна биология във всякакви видове кръвни банки 98 .

Въвеждането на NAT за откриване на дарения през прозорци в 300 000 до 3 000 000 дарения на кръв може да спаси около три живота в развитите страни, докато в развиващите се страни като Индия може да бъде 300 до 3000 пъти по-полезно в сравнение с развитите страни 90 .

Заключение

Тестовете за HCV на основата на нуклеинова киселина са намалили периода на своя период до около една седмица. Тази техника доказа своя напредък и нужди спрямо конвенционалните серологични методи 99. Следователно прилагането на NAT ще бъде от голяма полза за страните с ниски ресурси поради високото разпространение на HCV.