Инфекциозни заболявания

Тази статия е част от изследователската тема

Бактериална колонизация: Наблюдавана микробиота или началната стъпка на хроничното заболяване? Вижте всички 15 статии

Редактиран от
Бернд Крейкмайер

Университет в Росток, Германия

Прегледан от
Кристиан У. Ридел

Университет в Улм, Германия

Ян Буер

Университет на Дуйсбург-Есен, Германия

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

системни

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • Институт по микробиология, Charité - Universitätsmedizin Berlin, корпоративен член на Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin и Берлинския здравен институт, Катедра по микробиология и хигиена, Берлин, Германия

Въведение

Към днешна дата обаче няма данни относно имунните отговори на гостоприемника при иначе здрави P. aeruginosa носители с непокътнат чревен микробиотен състав. Следователно в настоящото проучване ние изследвахме дали мишките, приютяващи човешка срещу миша микробиота, могат да бъдат стабилно колонизирани от клиничен MDR P. aeruginosa щам и дали бактериалният носител е свързан с чревни или дори системни възпалителни отговори на гостоприемника.

Материали и методи

Декларация за етика

Всички опити с животни са проведени съгласно Европейските насоки за хуманно отношение към животните (2010/63/EU) с одобрение на комисията за опити с животни, оглавявана от „Landesamt für Gesundheit und Soziales“ (LaGeSo, Берлин; регистрационни номера G0039/15). Хуманното отношение към животните се наблюдава два пъти дневно чрез оценка на клиничните състояния и загубата на тегло на мишките.

Поколение на вторични абиотични мишки

Женски мишки C57BL/6j бяха отглеждани и отглеждани при SPF условия в Forschungsinstitute für Experimentelle Medizin (Charité - University Medicine, Берлин, Германия). Вторичните абиотични мишки с практически изчерпана микробиота са генерирани, както е описано по-рано (Heimesaat et al., 2006). Накратко, 8-седмични мишки бяха прехвърлени в стерилни клетки и подложени на широкоспектърно антибиотично лечение в продължение на 8 седмици чрез добавяне на ампицилин плюс сулбактам (1 g/L; Ratiopharm, Германия), ванкомицин (500 mg/L; Cell Pharm, Германия), ципрофлоксацин (200 mg/L; Bayer Vital, Германия), имипенем (250 mg/L; MSD, Германия) и метронидазол (1 g/L; Fresenius, Германия) към питейната вода (ad libitum). Културните и независими от културата (т.е. 16S рРНК базирани молекулярни) мерки за контрол на качеството разкриват виртуално отсъствие на бактерии във фекални проби, както е описано по-рано (Ekmekciu et al., 2017).

Трансплантация на човешка и миша фекална микробиота

Молекулярен анализ на суспензии за донори на хора и миши и фекалната микробиота

ДНК се извлича от фекални проби, както е описано по-рано (Heimesaat et al., 2006). Накратко, ДНК се определя количествено чрез използване на реагент Quant-iT PicoGreen (Invitrogen, Обединено кралство) и се коригира до 1 ng на μL. След това, TLs, както и основните бактериални групи в изобилие в миши и човешки чревни микробиоти, включително EB, EC, LB, Bif, B/P, Clocc, Clept и MIB, бяха оценени чрез qRT-PCR с видове, родове или групи -специфични 16S rRNA генни праймери (Tib MolBiol, Германия), както е описано по-рано (Heimesaat et al., 2010) и брой на 16S rRNA генни копия на ng ДНК на всяка определена проба.

MDR P. aeruginosa Инфекция и количествена оценка на фекалните натоварвания

MDR P. aeruginosa първоначално изолатът е култивиран от респираторен материал на пациент, страдащ от вътреболнична пневмония и любезно предоставен от проф. д-р Бастиан Опиц (Charité - University Medicine, Берлин, Германия). За отбелязване е, че клиничният бактериален щам е тестван устойчив срещу пиперацилин/тазобактам, цефтазидим, цефепим ± цефокситин, имипенем, ципрофлоксацин, гентамицин, тобрамицин, амикацин, триметоприм/сулфаметоксазол и азтреонам (според указанията на EUCAST fosmf само колистин (von Klitzing et al., 2017a). Преди инфекция, P. aeruginosa щам се отглежда върху цетримид агар (Oxoid) в продължение на 48 часа в аеробна атмосфера при 37 ° C.

На 0 и 1 ден мишките бяха предизвикани перорално с 10 9 CFU от MDR P. aeruginosa щам чрез сонда в общ обем от 0,3 ml PBS, както беше съобщено по-рано (von Klitzing et al., 2017a).

За количествена оценка на фекалиите P. aeruginosa натоварвания с течение на времето pi, фекални проби се хомогенизират в стерилен PBS, след това серийни разреждания се нанасят върху колумбийски агар, допълнен с 5% овча кръв (Oxoid, Германия) и цетримиден агар и се инкубират в аеробна атмосфера при 37 ° C за 48 часа, както е описано по-горе (von Klitzing et al., 2017a). Фекалните тегла се определят от разликата в теглото на пробата преди и след съхраняването. Границата на откриване на жизнеспособни бактерии е 100 CFU на g.

Клинични състояния

Макроскопското и/или микроскопичното изобилие от фекална кръв се оценява ежедневно при отделни мишки чрез метода Guajac, използвайки Haemoccult (Beckman Coulter/PCD, Германия), както е описано по-рано (Haag et al., 2012a).

Процедури за вземане на проби

Мишките са били жертвани 28 дни p.i. чрез третиране с изофлуран (Abott, Германия). Сърдечна кръв (за серум) и тъканни проби от далак, MLN, илеум и дебело черво бяха отстранени при стерилни условия. Чревни проби се събират от всяка мишка паралелно за микробиологични, имунологични и имунохистохимични анализи.

Имунохистохимия

Пет μm тънки парафинови участъци на дебелото черво и подвздошното ex vivo са използвани биопсии на място имунохистохимичен анализ, както е докладвано по-рано (Heimesaat et al., 2010; Alutis et al., 2015a, b). Накратко, първични антитела срещу разцепена каспаза-3 (Asp175, Cell Signaling, Бевърли, МА, САЩ, 1: 200), Ki67 (TEC3, Dako, Glostrup, Дания, 1: 100), F4/80 (# 14- 4801, клон BM8, eBioscience, 1:50) и B220 (eBioscience, 1: 200) бяха използвани за оценка на апоптотични клетки, пролифериращи клетки, макрофаги/моноцити и В лимфоцити, съответно. Средният брой положително оцветени клетки в рамките на най-малко шест HPF (0,287 mm 2; увеличение 400 пъти) е определен от независим заслепен изследовател.

Откриване на цитокини

Ex vivo биопсии (приблизително 1 cm 2), получени от дебелото черво и илеума (и двете се изрязват надлъжно и се измиват в PBS), както и MLN и далакът се поставят в плочки с култура с 24 плоски дъна (Falcon, Германия), съдържащи 500 ml без серум RPMI 1640 среда (Gibco, Life Technologies), допълнена с пеницилин (100 U/ml, Biochrom, Германия) и стрептомицин (100 μg/ml; Biochrom). След 18 часа при 37 ° C супернатантите за култура и серумните проби бяха тествани за TNF, IFN-γ и IL-10 чрез анализ на миши възпаление на цитометрични зърна (CBA; BD Bioscience) на BD FACSCanto II поточен цитометър (BD Bioscience) като описани по-рано (Haag et al., 2012b).

Статистически анализ

Медианите и нивата на значимост са определени с помощта на подходящи тестове (Mann-Whitney U тест, еднопосочен ANOVA и тест на Kruskal – Wallis), както е посочено. Двустранна вероятност (стр) стойности ≤ 0,05 се считат за значими. Експериментите бяха възпроизведени поне два пъти.

Резултати

Чревни P. aeruginosa Колонизация при мишки, приютяващи сложен човек срещу микробиота от миши черва

Поразително е, че имунните отговори след P. aeruginosa носенето не са били ограничени до чревния тракт, но могат да бъдат наблюдавани и системно, като се има предвид, че концентрациите на TNF, както и на IFN-γ са били повишени в далаците още 7 дни pi, докато нивата на IL-10 на далака са намалени в трансплантирана човешка фекална микробиота мишки по-късно. Доколкото ни е известно, ние тук за първи път показваме, че само чревен носител на MDR P. aeruginosa от клинично незасегнат гостоприемник води до изразени чревни, както и системни последствия. Това е още по-изненадващо, като се има предвид, че не всички разследвани мишки са били стабилни P. aeruginosa носители, допълнително подчертаващи патогенния потенциал на MDR P. aeruginosa.

Въпреки няколко съобщения за диария, причинена от P. aeruginosa при пациенти с предварително антибиотично лечение, P. aeruginosa не се разглежда като често срещан чревен патоген при здравия гостоприемник (Adlard et al., 1998; Kim et al., 2001). Още през 1918 г. обаче, „Шанхайска треска”, придобит в общността синдром, характеризиращ се с диария, треска и P. aeruginosa Съобщава се за сепсис с висока смъртност, засягащ новородени и деца без съществуващи съпътстващи заболявания предимно в азиатските популации (Dold, 1918; Chusid и Hillmann, 1987; Martin-Ancel et al., 1993; Viola et al., 2006; Chuang et al ., 2014).

Като се има предвид потенциалният кръстосан разговор между (опортюнистични) патогени и коменсални чревни бактерии, ние разгледахме дали промените в съответните чревни микробиотични състави могат да възникнат P. aeruginosa колонизация. Интересното е, че не е възможно да се наблюдават явни промени в чревната микробиота рано (т.е. 1 седмица) P. aeruginosa колонизация и бяха само незначителни при човешки фекални микробиоти, трансплантирани мишки след това. Предишни проучвания разкриват, че както острото, така и хроничното възпаление на тънките и дебелите черва при мишките са свързани с повишено натоварване на коменсала EB, което допълнително поддържа възпалителния сценарий чрез TLR-4-зависима сигнализация на липополизахарид (LPS) като грам-отрицателна съставка на бактериалната клетъчна стена (Heimesaat et al., 2006, 2007a, b, 2010; Erridge et al., 2010; Haag et al., 2012a, b; Otto et al., 2012). Въпреки това, въпреки наблюдаваните провъзпалителни имунни отговори с изразена чревна епителна апоптоза, последствия от чревен MDR P. aeruginosa превозът не е бил достатъчен, за да накара чревната микробиота да премине към свръхрастеж с потенциално провъзпалителни коменсали.

Заключение

Нашето проучване показва, че при сложна микробиота, възстановена от вторични абиотични мишки, установената чревна микробиота (независимо дали е от човешки или миши произход) не предотвратява в достатъчна степен гостоприемника от чревна колонизация с MDR P. aeruginosa щам. Освен това, само чревен носител на MDR P. aeruginosa представляват иначе здрави гостоприемници с риск да развият не само чревни, но дори системни провъзпалителни последствия. Бъдещите изследвания трябва допълнително да разгадаят молекулярните механизми, залегнали в основата на взаимодействията между тях P. aeruginosa, коменсалната микробиота и имунитета на гостоприемника при здраве и болести, за да се разработят стратегии, предотвратяващи колонизацията с MDR грам-отрицателни щамове, включително P. aeruginosa.

Принос на автора

EvK: проектира и извършва експерименти, анализирани данни, съредактирана хартия. IE: извършени експерименти, анализирани данни, съредактирана хартия. SB: предоставя съвети при проектирането и провеждането на експерименти, съвместно редактиран документ. МЗ: проектира и извършва експерименти, анализира данни, пише хартия.

Финансиране

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Германската изследователска фондация (DFG) за SB (SFB633, TP A7), MH (SFB633, TP B6) и EvK и IE (SFB633, Immuco) и от германските федерални министерства на образованието и научните изследвания (BMBF) към SB и MH (PAC-Campy 01KI1725D).

Изявление за конфликт на интереси

Авторите декларират, че изследването е проведено при липса на каквито и да било търговски или финансови отношения, които биха могли да се тълкуват като потенциален конфликт на интереси.

Благодарности

Авторите благодарят на Michaela Wattrodt, Ursula Rüschendorf, Alexandra Bittroff-Leben, Ines Puschendorf, Ulrike Fiebiger, Gernot Reifenberger и персонала на звеното за изследване на животни от Charité - University Medicine Berlin за отлична техническа помощ и отглеждане на животни.

Съкращения

Bif, бифидобактерии; B/P, Бактероиди/Prevotella spp .; CFU, единици, образуващи колонии; C. jejuni, Campylobacter jejuni; Изчистен, Clostridium leptum група; Clocc, Clostridium coccoides група; EB, ентеробактерии; EC, ентерококи; FMT, трансплантация на фекална микробиота; HPF, полета с висока мощност; Интензивно отделение, интензивно отделение; LB, млечнокисели бактерии; MDR, устойчив на много лекарства; MIB, Бактероиди на червата на мишката; MLN, мезентериални лимфни възли; P, двустранни стойности на вероятността; PBS, физиологичен разтвор, буфериран с фосфат; p.i., след инфекция; qRT-PCR, количествена полимеразна верижна реакция в реално време; SPF, без патогени; TL, общ еубактериален товар; TLR, Toll-подобен рецептор; СЗО, Световната здравна организация.

Допълнителен материал

ФИГУРА S1 | Фекален MDR P. aeruginosa натоварвания при мишки, които приютяват човешка срещу миша микробиота. Мишки с (А) миши или (Б) човешка чревна микробиота е била перорално предизвикана с MDR P. aeruginosa на ден 0 и ден 1. Плътностите на колонизацията на червата се оценяват във фекални проби в определени часови точки p.i. по култура. Медиани (черни ленти) и нива на значимост (стр-са показани стойности), определени от теста на Kruskal – Wallis. Брой проби, съдържащи съответната бактериална група от общия брой анализирани проби, са дадени в скоби. Данните бяха събрани от четири независими експеримента.

Цитиране: von Klitzing E, Ekmekciu I, Bereswill S и Heimesaat MM (2017) Чревни и системни имунни отговори при резистентност към множество лекарства Pseudomonas aeruginosa Колонизация на мишки, приютяващи човешка чревна микробиота. Отпред. Микробиол. 8: 2590. doi: 10.3389/fmicb.2017.02590

Получено: 29 август 2017 г .; Приет: 12 декември 2017 г .;
Публикувано: 22 декември 2017 г.

Бернд Крейкмайер, Университет в Росток, Германия

Ян Буер, Университет на Дуйсбург-Есен, Германия
Кристиан У. Ридел, Университет в Улм, Германия