Възпаление

Редактиран от
Рудолф Лукас

Медицински колеж в Джорджия, Университет Августа, САЩ

Прегледан от
Дениз Д. Белшам

Университет в Торонто, Канада

Хюго К. Кастро-Фария-Нето

Фондация Освалдо Круз (Фиокруз), Бразилия

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

затлъстяване

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • Отдел по биомедицински науки, Медицински факултет, Калифорнийски университет, Ривърсайд, Ривърсайд, Калифорния, САЩ

Въведение

Над половината от населението на САЩ е класифицирано като наднормено тегло, а цяла трета е класифицирано като затлъстяване (1). Броят на хората със затлъстяване нараства непрекъснато през последните 30 години (2). Това увеличение на затлъстяването съвпадна с увеличаване на съпътстващите заболявания, като диабет тип 2, сърдечно-съдови заболявания, инсулт и хипоталамусни нарушения, включително репродуктивни нарушения, които причиняват безплодие (3–6). Вредните ефекти на затлъстяването върху плодовитостта включват нередности в менструалния цикъл, аномалии в развитието на яйцеклетките, ановулация и повишен риск от спонтанни аборти при жени (3); и по-ниско качество на спермата, намалено количество сперма и по-ниски нива на тестостерон при мъжете (7). В момента 18% от двойките се нуждаят от асистирани репродуктивни технологии, за да забременеят (8), част от които може да произтичат от широко затлъстяване (9, 10). Въпреки че са изложени няколко хипотези (11–15), механизмите, при които затлъстяването влияе отрицателно върху репродуктивната функция, са неизвестни.

Затлъстяването се характеризира с хронично възпаление, в допълнение към промени в метаболитните маркери (31). Повишеното затлъстяване предизвиква увеличаване на възпалителните цитокини в кръвообращението (32, 33), като: фактор на туморна некроза (TNFα) и интерлевкини, IL-1β, IL-6 (34), главно поради инфилтрация на макрофаги в мастната тъкан и последващото им активиране. Доказано е, че възпалителните цитокини влияят отрицателно върху репродуктивната функция (35). Влиянието на острото възпаление върху репродукцията беше област на интензивно изследване и тези проучвания установиха, че приложението на LPS или цитокини в мозъчната камера намалява нивата на гонадотропин, намалява освобождаването на невропептид GnRH и потиска експресията на гена GnRH и LH (36–38). За разлика от острото, високо ниво на възпалителни цитокини, използвано в предишни проучвания, затлъстяването предизвиква хронично възпаление с ниска степен и ние изследвахме неговите ефекти върху репродукцията чрез GnRH неврони.

За да анализираме ефектите от възпаление, предизвикано от затлъстяване, върху репродуктивната функция, използвахме мишки, предизвикани от диета със затлъстяване (DIO). Наблюдават се значителни разлики в щамовете в отговор на диета с високо съдържание на мазнини (HFD) и щамовете A/J, FVB/NJ и BALB/cJ са устойчиви на DIO, докато DBA/2J и C57BL/6J наддават на тегло (39–41). Мишката C57BL/6J е особено верен модел на човешкия метаболитен синдром, тъй като развива затлъстяване, хиперинсулинемия, хипергликемия и хипертония, когато е позволено ad libitum достъп до HFD (42, 43). Тук ние демонстрираме дълбоки полови различия в отговор на HFD. По-конкретно, мъжките мишки C57BL/6J проявяват невровъзпаление, с произтичащо намаляване на броя на синаптичните бодли на GnRH неврони и намаляване на нивата на mRNA на GnRH. От друга страна, женските мишки са устойчиви на невроендокринни и възпалителни промени и тази защита е независима от хормоните на яйчниците. Заедно нашите данни включват специфични за секса ефекти при индуцирано от затлъстяването невро възпаление с функционални последици върху GnRH невроните.

Материали и методи

Животни

C57BL/6J мишки са получени от лабораторията Jackson на 3-седмична възраст. След едноседмична аклиматизация те бяха разпределени на случаен принцип в групата с високо съдържание на мазнини (HFD, D12492, 60% kcal от мазнини; Research Diet, New Brunswick, NJ) и контролната група (Ctr, D12450J, 10% kcal; Research Diet, New Brunswick, NJ) за посочен брой седмици. Животните се поддържат при 12-часов светлинен, 12-часов тъмен цикъл и получават храна и вода ad libitum. Всички експерименти са проведени с одобрение от Комитета за грижа и употреба на животните в Университета на Калифорния и в съответствие с Националните институти по здравеопазване Насоки за грижи и употреба на животните с използване на 16-седмични животни (3 седмици преди отбиването, 1 седмица нормално чау, 12 седмици диета с високо съдържание на мазнини или контрол), освен ако не е посочено друго. През седмицата между отбиването и експерименталната диета, докато се хранят с нормална чау, всички животни се обработват ежедневно от опитен персонал, за да се гарантира привикване и да се сведе до минимум стресът (44).

За флуоресцентно белязани микроглии, CX3CR1-GFP мишки са получени от лаборатории Jackson (щам 005582) и произволно поставени върху съответните диети на 4-седмична възраст, за да се анализира промяната в морфологията на микроглията. Двойно флуоресцентни GFP и RFP трансгенни мишки, получени след кръстосване на CX3CR1-GFP (щам 005582) и CCR2-RFP (щам 017586), и хетерозиготни мишки за двата алела бяха използвани за разграничаване на набирането на моноцити в хипоталамуса от резидентната микроглия. GnRH-GFP мишки бяха любезно предоставени от д-р Suzanne Moenter (45). Мъжете и жените са анализирани отделно, за да се определят половите разлики. Анализирани са поне 10 животни на пол за генотип, освен ако не е посочено друго за специфичен анализ в раздела за материали и методи. Статистически разлики (стр ® 780 (1: 300, 47-0451, eBioscience, Сан Диего, Калифорния) и анти-CD11b PerCP-Cyanin5.5 (1: 300, 45-0112, eBioscience, Сан Диего, Калифорния) в PBS, 5% EDTA, 0,4% BSA. Sytox ™ Зелено мъртво петно ​​(30 nM, S-34860, ThermoFisher, Chino, Калифорния) беше използвано за изключване на мъртви клетки и анализ на потока, извършен с помощта на BD LSR II Flow Cytometer. Резултатите бяха анализирани с помощта на софтуера FlowJo (Tree Star, Inc.) и статистическите разлики бяха определени чрез T-тест на Student и posthoc тест на Tukey.

маса 1. Антитела.

Хистологични анализи и имунохистохимия

След Ctr или HFD мишките бяха анестезирани, перфузирани с 20 ml PBS и 20 ml 4% параформалдехид; и събрани тъкани. Мозъците бяха фиксирани в 4% параформалдехид, вградени в парафин и нарязани на 20 μm. Слайдовете бяха депарафинизирани в ксилен и рехидратирани. Демаскирането на антигена се извършва чрез нагряване в продължение на 10 минути в Tris-EDTA-0.3% Triton X и ендогенната пероксидаза се потушава чрез инкубиране за 10 минути в 0.3% водороден пероксид. След това предметните стъкла бяха блокирани с 20% кози серум и инкубирани с първичен антисерум срещу GnRH (1: 1000 PA1-121, Thermo Sci.) Или Iba-1 за микроглии (1: 300 cat # 019-19741, Wako) за една нощ при 4 ° ° С. След измиване с PBS, предметните стъкла се инкубират с биотинилиран кози анти-заешки IgG (1: 300, BA-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA) за 30 минути. Елитният комплект Vectastain ABC (Vector Laboratories) е използван съгласно инструкциите на производителя, след което комплектът DAB пероксидаза е използван за колориметрично оцветяване. Плъзгачите бяха дехидратирани в етанол и ксилол и покрити с Vectamount (Vector Laboratories).

За да се визуализират маркирани с GFP микроглии от мишки CX3CR1-GFP и активирани макрофаги, маркирани с червено и микроглия, маркирани със зелено от мишки CCR2-RFP x CX3CR1-GFP, след 12 седмици Ctr или HFD мишките се анестезират, перфузирани с 20 ml PBS, последвани от 20 мл 4% параформалдехид; мозъците бяха фиксирани в 4% параформалдехид, замразени в ОСТ и нарязани на 20 μm участъци с помощта на Leica криостат. Ендогенната флуоресценция се визуализира с микроскоп Leica.

Западно петно

Цели клетъчни лизати са получени от дисектирани хипоталами от мишки, хранени с Ctr и HFD и след определяне на протеина, същото количество протеин се пуска върху SDS-PAGE, прехвърля се върху нитроцелулозна мембрана и се сондира за: протеин на постсинаптична плътност 95 (PSD-95; 1: 1000, Cat # 3409, Cell Signaling), Synaptophysin (SYPH; 1: 1000, cat. # 4329, Cell Signaling), невронален маркер, свързан с микротубули протеин 2 (MAP2; 1: 5000, cat # ab5392, Abcam) или β-тубулин (1: 1000, cat # sc-9104, Santa Cruz Biotechnology). Лентите бяха количествено определени с помощта на система за изображения ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA).

qPCR анализи

Хипоталамите бяха дисектирани, извлечена обща РНК и обратна транскрипция, използвайки Superscript III (Invitrogen, СА). qPCR беше извършен с помощта на iQ SYBR Green супермикс и IQ5 PCR машина в реално време (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) с праймери, изброени в Таблица 2, при следните условия: 95 ° C за 15 минути, последвани от 40 цикъла при 95 ° C за 20 s, 56 ° C за 30 s и 72 ° C за 30 s. Количеството на гена, който представлява интерес, се изчислява чрез сравняване на праговия цикъл, получен за всяка проба, със стандартната крива, генерирана в същия цикъл. Репликите бяха осреднени и разделени на средната стойност на гена за поддържане на бета-2-микроглобулин (B2M) в същата проба, използвайки ΔΔ Ct метод. Предварителните проучвания, анализиращи гените за домакинство на GAPDH, Ywaz, TBP и B2M, установяват, че B2M не се променя с диетата и впоследствие е използван за нормализиране. След всеки цикъл се извършва анализ на кривата на топене, за да се потвърди, че във всяка реакция се генерира единичен ампликон. Статистическите разлики в експресията между генотипите са определени от Student's т-тест и HSD на Tukey за множество сравнения с помощта на JMP софтуер (SAS Institute; Cary, North Carolina).

Таблица 2. Грундове.

Резултати

Мъжките мишки на диета с високо съдържание на мазнини показват по-ниски нива на репродуктивни хормони

C57BL/6J мъжки и женски мишки бяха поставени на диета с високо съдържание на мазнини (HFD) или контролна диета (Ctr) 1 седмица след отбиването и теглото им се измерва два пъти седмично. Както беше демонстрирано по-рано (26), мъжките мишки наддават на тегло при HFD, докато женските мишки са били устойчиви на индуцирано от диетата затлъстяване (DIO) и са се нуждаели от по-продължително излагане на HFD, за да покажат същата разлика в теглото от мишки на контролна диета (Фигура 1А, мъже; Фигура 1В, женски). Предварителните проучвания показват, че жените, изложени на HFD за същия период от време, както мъжете, не показват неблагоприятни ефекти от затлъстяването, илюстрирани по-долу, докато много по-продължителната експозиция би увеличила риска от объркване на резултатите ни с негативни ефекти от стареенето; по този начин решихме да запазим женските на HFD, докато достигнат подобно наддаване на тегло като мъжете. За да определим дали яйчниковите естрогени или други яйчникови хормони играят роля в тази полова разлика, ние овариектомизирахме (OVX) женските на 4-седмична възраст и ги поставихме на HFD и Ctr. Жените от OVX станаха податливи на DIO (Фигура 1C). Тези резултати показват, че яйчниковите хормони предпазват от DIO.

Фигура 9. Инфилтрация на периферни макрофаги в хипоталамуса на мъжките мишки върху HFD, но не и женски. (А), График на поточна цитометрия, показващ присъствието на популацията на CD45 с висок макрофаг, която може да бъде разграничена от ниската микроглия на CD45, по-специално в хипоталамите на HFD мъжки мишки, но не и при женските. Тази популация не присъства в кората при мъжки или женски мишки. (Б), Количественото определяне на А. Статистическата значимост (*) между Ctr (сиви ленти) и HFD (черни ленти) се определя от Student's т-тест, последван от posthoc тест на Tukey.

За да локализираме резидентни микроглии и набрани макрофаги, получени от моноцити, генерирахме двойни трансгенни мъжки мишки CX3CR1-GFP и CCR2-RFP. CX3CR1 е фракталкинов рецептор, експресиран специално от микроглията в мозъка. CCR2 е хемокинов рецептор, участващ в хемотаксиса на моноцитите и инфилтрацията; по този начин, присъствието на RFP експресия под контрола на CCR2-промотор би показало инфилтриране на активирани макрофаги. Тези мишки бяха поставени на Ctr и HFD. В Ctr само зелено маркираните микроглии, положителни за CX3CR1, присъстват в дъгообразното ядро ​​на медиобазалния хипоталамус (Фигура 10, коронарен разрез с 3-та камера в дясната част на изображението), докато в HFD, RFP-маркирани инфилтриращи макрофаги са локализирани в мозъчния паренхим в допълнение към GFP-маркираната резидентна микроглия. Като цяло тези резултати показват, че набирането на периферен макрофаг в хипоталамусния паренхим след HFD се случва само при мъжки мишки.

Фигура 10. CCR2-положителните макрофаги се локализират в паренхима на дъгообразното ядро. Двойно флуоресцентни мишки, където активираните макрофаги са генетично белязани с червено с CCR2-RFP, а резидентните микроглии са означени със зелено с CX3CR1-GFP, бяха поставени върху контролата и HFD. Дълговидните ядра на мишките на контролна диета съдържат само зелена флуоресценция, докато дъговидните ядра на мишките на HFD съдържат зелена флуоресценция на резидентната микроглия, а червената флуоресценция показва инфилтрация на периферни макрофаги.

Намаляване на плътността на невроновите шипове на GnRH в хипоталамуса на затлъстели мъжки мишки

Инфилтрацията на макрофаги и повишените възпалителни цитокини в хипоталамуса могат да доведат до елиминиране на синапса (64–66); и последваща дисрегулация на GnRH неврони, което може да обясни намалените нива на GnRH, LH и тестостерон при мъжки мишки на HFD. Като се има предвид, че не открихме никакви промени в броя на GnRH невроните, ние след това установихме дали има синаптични промени в хипоталамите на HFD мъжки мишки и по-специално GnRH неврони. Western blot анализите разкриват по-ниски нива на възбуждащ постсинаптичен плътност (PSD) 95 протеин в хипоталамите на HFD мъжки мишки, докато не се наблюдават промени в общите нива на пресинаптичния протеин синаптофизин (SYPH), обикновено открит и при двете възбуждащи и инхибиторни пресинаптични сайтове (Фигура 11А). За разлика от това, нивата на PSD-95 и синаптофизин са непроменени в хипоталамите на женски мишки на HFD в сравнение с женските Ctr (Фигура 11В). Нашите резултати показват промени в нивата на синаптичен протеин в хипоталамуса на мъжки мишки, които са податливи на DIO, но не и устойчиви на невро-възпаление женски мишки.

Фигура 11. Намалени нива на PSD-95 синаптичен протеин в хипоталамите на мъжки мишки на HFD. Western blot с използване на хипоталамусни лизати показват по-ниски нива на постсинаптичен плътност протеин 95 (PSD-95), но не и на пресинаптичен протеин синаптофизин (SYPH) при мъжете (А) но не и при жените (Б). * Показва статистическа значимост стр Ключови думи: специфични за пола, цитокини, GnRH, невровъзпаление, затлъстяване, хипоталамус

Цитиране: Lainez NM, Jonak CR, Nair MG, Ethell IM, Wilson EH, Carson MJ и Coss D (2018) Диета, предизвикана от затлъстяване, предизвиква инфилтрация на макрофаги и намаляване на плътността на гръбначния стълб в хипоталамите на мъжки, но не и женски мишки. Отпред. Имунол. 9: 1992. doi: 10.3389/fimmu.2018.01992

Получено: 04 юни 2018 г .; Приет: 13 август 2018 г .;
Публикувано: 11 септември 2018 г.

Рудолф Лукас, Университет Августа, САЩ

Дениз Д. Белшам, Университет в Торонто, Канада
Hugo Caire Castro-Faria-Neto, Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), Бразилия