Интегративна и регенеративна фармакология

Тази статия е част от изследователската тема

Напредък в биофармацевтиката Вижте всички 25 статии

Редактиран от
Виктор Ерохин

Институт за материали за електроника и магнетизъм, Италиански национален изследователски съвет, Италия

Прегледан от
Кристофър Д. Порада

Уейк Форест Училище по медицина, САЩ

Александър А. Сосунов

Колумбийският университет, САЩ

Виктор Арванян

Медицински център Northport VA, САЩ

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

граници

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Катедра по биология, Казански държавен медицински университет, Казан, Русия
  • 2 Изследователски институт по епидемиология и микробиология Gamaleya, Москва, Русия
  • 3 Институт по фундаментална медицина и биология, Казански федерален университет (Поволжие), Казан, Русия
  • 4 Казански научен център, Казански институт по биохимия и биофизика, Руска академия на науките, Казан, Русия
  • 5 Катедра по неврологична хирургия, клиника Майо, Рочестър, Минесота, САЩ
  • 6 Катедра по физиология и биомедицинско инженерство, клиника Мейо, Рочестър, Минесота, САЩ

Въведение

Фактор на съдов ендотелен растеж (VEGF)

Съдовият ендотелен растежен фактор (VEGF) има известен директен невропротективен ефект върху невроните на гръбначния мозък на плъхове, който може да бъде медииран инвитро чрез VEGFR2/Flk-1 рецептори (Ding et al., 2005). Значението за поддържане на продукцията на VEGF е продиктувано от ниското му ниво в увредения гръбначен мозък (Herrera et al., 2009). Доказано е, че VEGF може да намали вторичната дегенерация на невроните и да подобри функционалния резултат при експериментална SCI (Widenfalk et al., 2003). Доставката на VEGF от нервни стволови клетки може да подобри пролиферацията на глиални предшественици, ангиогенезата и да подобри щаденето на тъканите след SCI (Kim et al., 2009). Аденовирусно доставеният биоинженериран фактор за транскрипция на цинков пръст, предназначен да активира експресията на всички изоформи на ендогенния VEGF-A, доведе до отслабване на аксоналната деградация, намалено ниво на апоптоза, значително увеличение на васкуларността, подобрения в поведенческите резултати след SCI ( Liu et al., 2010; Figley et al., 2014).

Извлечен от глиал невротрофичен фактор (GDNF)

Извлеченият от глията невротрофичен фактор (GDNF) е добре известен фактор за спасяване на неврони след исхемия, невродегенерация или невротравма. Интраспиналната инжекция на рекомбинантен аденовирус, носещ рекомбинантен ген на GDNF в увредения гръбначен мозък, може да запази невронните влакна и да насърчи функционално възстановяване след SCI (Tai et al., 2003). Наскоро на модела на плъхове на SCI демонстрирахме, че медиираната от UCB-MCs терапия с GDNF може да подобри щаденето на тъканите, въпреки че броят на миелинизираните влакна е по-висок в сравнение с броя на влакната, измерен след директно инжектиране на Ad-GDNF (Mukhamedshina et al., 2016б). Нещо повече, в това проучване наблюдавахме различни молекулярни реакции в различните популации на глиални клетки в различни области на посттравматичния гръбначен мозък на плъхове.

Индуцируем от хипоксия фактор ангиогенин (ANG)

Индуцируемият от хипоксия фактор ангиогенин (ANG) насърчава оцеляването на мотоневрона и двете инвитро и in vivo Kieran et al., 2008). ANG е невронално секретиран фактор, който се ендоцитира от астроглията и медиира невропротекцията по паракринен начин (Skorupa et al., 2012). Ролята на този фактор в патофизиологията на ТЗО е слабо разбрана. Основни данни за ролята на ANG върху регенерацията на гръбначния мозък са получени в ALS модели. По този начин, ALS мишки, инжектирани с комбинацията Ad-VEGF + Ad-ANG, показват 2-3 седмично забавяне в проявата на заболяването, по-висока двигателна активност в напредналите стадии на заболяването и увеличаване на продължителността на живота (Ismailov et al., 2014).

Молекулата L1

Материали и методи

Подготовка на аденовирусни вектори и генетично инженерни UCB-MC

Това проучване беше прегледано и одобрено от институционален комитет за преглед „Комитет за грижи за животните в Казанския държавен медицински университет“ и всички процедури бяха извършени съгласно протокол „Работа с хематопоетични стволови клетки. SMK-MI-02.04-07, ”лиценз FS-16-01-001421.

Аденовирусни вектори

Аденовирусните вектори, носещи гени VEGF165, GDNF, ANG, NCAM1 и зелен флуоресцентен протеин (GFP), са генерирани по метода на хомоложната рекомбинация, базирана на човешкия аденовирусен серотип 5 (Ad5) в Изследователския институт по епидемиология и микробиология на Гамалея (Москва, Русия) като описани по-рано (Shcherbinin et al., 2014). За инжектиране 2 × 10 7 вирусни частици Ad5-GFP в 20 μl физиологичен разтвор; 2 × 10 7 смеси от вирусни частици от Ad5-VEGF165, Ad5-GDNF и Ad5-NCAM1 в 20 μl физиологичен разтвор; и 2 × 10 7 смеси от вирусни частици от Ad5-VEGF165, Ad5-ANG и Ad5-NCAM1 в 20 μl физиологичен разтвор.

Мононуклеарни клетки

Мононуклеарни клетки от човешка кръв от пъпна връв (UCB-MCs) бяха изолирани чрез стандартна техника на утаяване до бариера на плътността (Ficoll, 1.077g/ml), както е описано по-рано (Islamov et al., 2015) въз основа на лиценза на Казанската държава Банка на стволови клетки на Медицинския университет. Получени са генно инженерни UCB-MCs след трансдукция на клетките с Ad5-GFP при MOI 10; едновременно с Ad5-VEGF165, Ad5-GDNF и Ad5-NCAM1 при MOI 10; и едновременно с Ad5-VEGF165, Ad5-ANG и Ad5-NCAM1 при MOI 10. За инжектиране 2 × 10 6 UCB-MCs + Ad5-GFP в 20 μl физиологичен разтвор; 2 × 10 6 UCB-MCs + Ad-VEGF165 + Ad-GDNF + Ad-NCAM1 в 20 μl физиологичен разтвор; и 2 × 10 6 UCB-MCs + Ad-VEGF165 + Ad-ANG + Ad-NCAM1 в 20 μl физиологичен разтвор.

Оценка на експресията на трансгени инвитро

За количествен анализ на PCR с обратна транскрипция (qRT-PCR) UCB-MC се събират пет дни след трансдукция с Ad5-VEGF165, Ad5-GDNF и Ad5-NCAM1. Общата РНК от генетично конструирани UCB-MCs се изолира, използвайки TRIZOL (Invitrogen). cDNA бяха получени чрез 100 U Maxima обратна транскриптаза (Thermo Scientific, САЩ). За да се определи скоростта на експресия на VEGF165, се използва метод GDNF и NCAM1 TaqMan. Всички праймери и сонди, използвани в изследването, са изброени в Таблица 1. Извършена е PCR в реално време и резултатите са анализирани с CFX 96 RealTime PCR система (Bio-Rad). Нивото на иРНК се нормализира, като се използва 18S рРНК като домакински ген. За всяка проба PCR реакциите се провеждат в три екземпляра. Нивата на cDNA се определят, като се използва стандартната крива. Стандартите, използвани за стандартната крива, са генерирани, като се използват серийни разреждания на плазмидна ДНК със съответни cDNA вложки. Нивото на експресия на целевите гени в наивен (нетрансдуциран) UCB-MC се счита за 100%.

маса 1. RT-PCR праймери и сонди TaqMan.

С помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) се изчислява нивото на разтворим VEGF в кондиционираната културална среда след инкубация на UCB-MCs, трансдуцирани с Ad5-VEGF165, Ad5-GDNF и Ad5-NCAM1. След трансдукция UCB-MCs бяха инкубирани в продължение на 96 часа при 37 ° С във влажна атмосфера, средата беше събрана и центрофугирана при 3000 g в продължение на 10 минути, филтрирана през 0.22 μm филтър. Концентрацията на VEGF в кондиционирана среда беше измерена с VEGF DuoSet ELISA комплект от R&D Systems (# DY293B DuoSet) съгласно протокола на производителя. UCB-MC, трансдуцирани с Ad5-GFP, бяха изследвани 96 часа след инкубация с помощта на флуоресцентна микроскопия за оценка на експресията на зеления флуоресцентен протеин.

Животни и лечение

В това проучване са използвани петдесет и четири женски плъхове Wistar (лаборатория Пушино, Русия) с тегло 250–300 g. Плъховете бяха настанени по една на клетка при стандартни лабораторни условия с неограничен достъп до храна и вода и 12-часов график светлина/тъмнина. Експерименталният протокол беше в съответствие с препоръките на Физиологичната секция на Руския национален комитет по биоетика. Всички лечения за животни, анестезия, хирургия, следоперативни грижи, перфузия и евтаназия в крайните точки бяха одобрени от Комитета за грижа за животните на Казанския държавен медицински университет (Разрешение номер 5, от 27 май 2014 г.). Преди операцията животните бяха разпределени на случаен принцип в седем експериментални групи (Таблица 2).

Таблица 2. Експериментални групи.

Фигура 1. Експериментален дизайн. (А) Травма на гръбначния мозък и интратекална инжекция; (Б) Фрагмент на гръбначния мозък (30 mm), разделен на три сегмента: рострален (10 mm) и каудален (10 mm) от епицентъра на нараняване (10 mm); (° С) Зони на гръбначния мозък, използвани за имунофлуоресцентно оцветяване. Избрани са седем области на гръбначния мозък: вентрален рог (VH); вентрален кортикоспинален тракт (CST); дорзална зона за влизане на корен (DREZ); площ на централния канал (CC); гръбни фуникули (DF); вентралните фуникули (VF); външна зона на страничните фуникули на линията, минаваща през централния канал (LF).

Оценка на двигателната активност

Всички животни бяха оценени за локомоция на открито, използвайки оценката на Basso-Beattie-Bresnahan (BBB). Тестът за функционално възстановяване е проведен, започвайки от седмия ден след операцията и е последван с дневен интервал и завършен при 30 dpi.

Хистологична оценка

За имунофлуоресцентен анализ секции бяха промити в PBS с 1% Triton X-100 (Sigma) три пъти за 5 минути и блокирани в 5% нормален кози серум за 1 h при стайна температура (RT). За имунофлуоресцентни маркиращи секции се третират една нощ при 4 ° С с комбинация от първични антитела (Таблица 3), последвано от инкубация в смес от вторични антитела за 2 h при RT. DAPI (10 μg/ml в PBS, Sigma) се използва за визуализация на ядра. Разтвор на пропидиев йодид (PI, 5 μg/ml в PBS, Sigma) се използва за оцветяване както на ДНК в ядрото, така и на РНК в цитоплазмата (Нисл вещество в невроните) (Niu et al., 2015). Обработените секции бяха монтирани на предметни стъкла, вградени в глицерол (GalenoPharm; Санкт Петербург, Русия) и наблюдавани под микроскоп LSM 510-Meta (Carl Zeiss; Oberkochen, Германия).

Таблица 3. Първични и вторични антитела, използвани при имунофлуоресцентно оцветяване.

Статистически анализи

Имунофлуоресцентно оцветяване и инвитро Данните от молекулярния анализ са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). За да определим статистическа значимост, използвахме студентска т-разпределение на теста или еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) с теста на Тюки. Стойност от 0,05 се счита за статистически значима. Данните бяха анализирани с помощта на софтуера Origin 7.0 SR0 (OriginLab, Northampton, MA). За да определим статистическа значимост на данните от BBB, използвахме U Wilcoxon-Mann-Whitney тест, използвайки софтуера SPSS Statistics 22 (IBM, Armonk, New York, US), където стр + -клетки (червени), експресиращи VEGF (зелени). (Б) HNA + -клетки (червено), изразяващи GDNF (зелено). (° С) HNA + -клетки (червено), изразяващи ANG (зелено). (Д) HNA + -клетки (червено), изразяващи NCAM (зелено). Посочените клетки съответстват на морфологията на мононуклеарните клетки от пъпна връв с кръгли ядра, заобиколени от тънък ръб на цитоплазма.

Експресия на невронни и глиални молекулярни маркери в опашната гръбначна връв

HSP27

Намаляването на експресията на Hsp27 в VH е установено във всички терапевтични групи в сравнение с групата на физиологичен разтвор (29,56 ± 3,47) (Фигура 6). Този ефект е най-забележим в групите UCB-MC + Ad-VEGF-GDNF-NCAM (13,67 ± 0,85) и Ad-VEGF-GDNF-NCAM (13,84 ± 0,39). Намаляването на експресията на Hsp27 в UCB-MCs + Ad-GFP група не е потвърдено (Фигура 6).

Фигура 6. Експресия на Hsp27. Горен панел: Имунофлуоресцентно оцветяване на каудалните гръбначно-мозъчни сечения с Abs срещу Hsp27 (червено) каудално до мястото на увреждане в контролни (физиологичен разтвор) и терапевтични групи. Ядрата (сини) бяха оцветени с DAPI. Мащабна лента = 50 μm. Долен панел: Хистограма на статистическия анализ на Hsp27-позитивния брой клетки в VH зона. Данните са представени като средни SEM, *стр Ключови думи: увреждане на гръбначния мозък, глиални клетки, генна терапия, мононуклеарна клетка на кръв от пъпна връв, съдов ендотелен растежен фактор, невротрофичен фактор, получен от глиални клетки, ангиогенин, молекула на адхезия на нервни клетки

Цитиране: Измайлов А.А., Повишева Т.В., Баширов Ф.В., Соколов М.Е., Фадеев Ф.О., Гарифулин Р.Р., Народицки Б.С., Логунов Д.Я., Салафутдинов И.И., Челишев Ю.А., Исламов Р.Р. и Лавров И.А. (2017) Молекулярни и клетъчни промени в гръбначния мозък - и клетъчно медиирана тройна генна терапия след тежка контузия. Отпред. Pharmacol. 8: 813. doi: 10.3389/fphar.2017.00813

Получено: 03 август 2017 г .; Приет: 26 октомври 2017 г .;
Публикувано: 13 ноември 2017 г.

Виктор Ерохин, Istituto Materiali per Elettronica e Magnetismo IMEM-CNR, Италия

Кристофър Д. Порада, Медицинско училище Уейк Форест, САЩ
Александър А. Сосунов, Колумбийски университет, САЩ
Виктор Арванян, медицински център Northport VA (VHA), САЩ