1 Катедра по фармацевтични науки, Университет на Перуджа, Via Fabretti No. 48, 06123 Перуджа, Италия

серотонинов

2 Катедра по клинични и биологични науки, Университет в Удине, Пиацале Колбе № 4, 33100 Удине, Италия

3 Отделение за хранително разстройство, Палацо Франциски Тоди, USL 1 Умбрия, Via Cesia No. 65, 06059 Тоди, Италия

Резюме

1. Въведение

Хранителните разстройства, като анорексия (AN) и булимия (BN), са класически описани с ясен женски превес [1]. АН е психопатология, характеризираща се с неумолимия стремеж към изтъняване и/или болезнен страх от затлъстяване, а БН се характеризира с повтарящи се епизоди на преяждане, при които се консумират големи количества храна за кратки периоди [2]. И двете често са придружени от съпътстващи психиатрични разстройства, т.е. афективни, тревожни и личностни разстройства [2]. Хранителните разстройства имат многофакторна етиология, от ендокринни аномалии до генетични, психологически и екологични фактори [3]. Хората с AN и BN постоянно се характеризират с перфекционизъм, обсесивно-компулсивност и дисфорично настроение [4].

Витамин D3 е признат, че има различни извънскелетни роли, като действа като парахормон. Последните доказателства свързват дефицита на серумен витамин D3 със затлъстяването, диабета, сърдечно-съдовите рискове, рака [5], когнитивните увреждания и деменцията [6]. Противовъзпалителната активност на витамин D3 привлича все повече и повече внимание на изследователите да изследват ролята му в регулирането на прогресията на възпалителните заболявания [7] като важен регулатор на вродения имунитет [8]. Недостигът на витамин D3 се свързва с възпалителни заболявания на червата [9], хронични бъбречни заболявания [10], астма и атопия [11]. Досега дефицитът на витамин D3 при пациенти с хранителни разстройства корелираше само с риска от остеопороза [12, 13]. Известно е, че витамин D3 модулира пероксизомен пролифератор-активиран рецепторен гама (PPARγ) [14], молекула, участваща в възпаление, свързано с диетата [15, 16].

Целта на работата беше да се подчертае връзката между тежка хиповитаминоза D3, намаляване на рецептора на витамин D (VDR), левкопения и 5-HTTLPR при пациенти с дългосрочни AN и BN.

2. Методи

2.1. Декларация за етика

Всички участници предоставиха писмено информирано съгласие преди включването в този проект и бяха третирани в съответствие с Декларацията от Хелзинки. Протоколът и процесът на изследването бяха оценени и одобрени от Комитета по етика на Aziende Sanitarie (CEAS) della Regione Umbria, Италия.

2.2. Пациенти

Кръвни проби от 18 пациенти, засегнати от AN (n. 11) и/или BN (n. 7), бяха събрани за 15-месечен период (октомври 2014 г. - януари 2015 г.) от Отдела за хранително разстройство, Palazzo Francisci (USL 1 Umbria, Тоди, Италия). Популацията се състоеше от всички жени; средната възраст е била 40 години (диапазон 14–65 години). Химико-клиничните анализи са извършени в диагностичната лаборатория на Тоди (USL 1 Umbria, Италия). Пълна кръв, центрофугирани клетки и серум се съхраняват при -20 ° C, докато се използват за анализ на витамин D3, имуноблотинг и анализ на генотипирането.

2.3. Материали

Стандартният витамин D3 е получен от Sigma Chemical Co. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ); анти-пероксизомен пролифератор-активиран рецептор гама (PPARγ) и антитела срещу витамин D рецептор (VDR) са получени от Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Калифорния, САЩ).

2.4. Клинични мерки

Теглото и височината на участниците бяха оценени. Измервани са нивата на тиреоидни хормони, хемохром, чернодробни и бъбречни параметри, желязо, феритин, холестерол, триглицериди, протеини, витамин В12 и фолиева киселина.

2.5. Тестове за серум за витамин D3

Нивата на серумен витамин D3 се измерват по LC/MS/MS метод. Преди анализа пробата се приготвя чрез добавяне на 150 μL реагент за утаяване, съдържащ вътрешен стандарт, до 50 μL серум на пациента или серум за контрол на качеството; след 10 минути инкубация, 50 μИнжектира се L супернатант. Сигналът от аналитите се измерва спрямо калибрационната крива с помощта на софтуера MultiQuant 2.1. За анализ, система Shimadzu UFLC-XR, Shimadzu, Киото, Япония, оборудвана с дегазатор DGU-20A3, двоична помпа LC-20AD XR, автосамплер SIL-20ACXR, колонна фурна CTO-20AC и комуникационен модул CBM-20A беше използван. Системата UFLC е свързана с масов спектрометър с линейно йонно улавяне 4000 QTRAP (AB Sciex, Concord, ON, Канада), оборудван с APCI източник, работещ в режим на положителна йонизация. Между хроматографската система и масспектрометъра беше поставен 6-портов автоматичен превключващ клапан. Софтуерът на контролера беше Analyst версия 1.6. Границата на откриване (LLOD) за този анализ беше 0,67 μg/L. Долната граница на количествено определяне (LLOQ) беше 2,25 μg/L, а линейността е била 2.25–250 μg/L. CV са 6% при различни концентрации в целия аналитичен обхват на измерване.

2.6. Електрофореза и анализ на Western Blot

Анализът беше извършен, както беше съобщено по-рано [25]. 30 μg протеин се използва за SDS-PAGE електрофореза в 10% полиакриламиден плочен гел. Протеините се прехвърлят в нитроцелулоза за 90 минути и мембраните се блокират за 30 минути с 0,5% без мазнини сухо мляко в PBS, рН 7,5 и се инкубират за една нощ при 4 ° C с антитяло анти-PPARγ или VDR. Петната бяха инкубирани с конюгирани с хрян вторични антитела в продължение на 90 минути. Реакцията на засилена хемилуминесценция (ECL) се извършва с ECL кит от Amersham (Rainham, Essex, UK). Имуноблоти от протеини се изследват повторно след отстраняване. Привидното молекулно тегло на протеините се изчислява според стандарта за миграция на молекулния размер. Плътността на площта на лентите беше оценена чрез денситометрично сканиране и анализирана с Scion Image.

2.7. Генотипизиране на 5-HTTLPR

Геномна ДНК (gDNA) беше извлечена от проби от цяла кръв, използвайки QIAamp® DNA Mini kit (QIAGEN). Генотипизирането на 5-HTTLPR полиморфизма се извършва чрез полимеразна верижна реакция, използвайки Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific). Използвана е следната двойка праймери: 5′-GGCGTTGCCGCTCTGAATGC-3 ′ (праймер напред), 5′-GAGGGACTGAGCTGGACAACCAC-3 ′ (грунд обратен) [26, 27]. Усилването на

50 ng gDNA се извършва след 30 ′ ′ първоначална денатурация при 98 ° C в продължение на 35 цикъла (денатурация при 98 ° C за 15 ′ ′, отгряване при 69 ° C за 30 ′ ′ и екстензия при 72 ° C за 15 ′ ′), Последвано от окончателно удължаване при 72 ° C за 5 ′. 10 μL аликвотни части от всеки PCR продукт се разтварят с 2,5% агарозна гел електрофореза в 1x TBE буфер при 90 волта. Генотипът се определя от размерите на фрагменти: 484 bp (S, къс алел) и 528 bp (L, дълъг алел). 100 bp SHARPMASS (Евроклон) беше използван като ДНК стълба.

2.8. Статистически анализ

За всеки анализ бяха извършени три експеримента, извършени в два екземпляра. Данните са изразени като средно ± SD и

-тестът е използван за статистически анализ.

3. Резултати и дискусия

3.1. Резултати

Пациентите с AN (№ 11) и BN (№ 7) са избрани да имат нормален профил на кръвен тест като хормони на щитовидната жлеза, чернодробни и бъбречни параметри, триглицериди, протеини, витамин В12 и фолиева киселина. По този начин бяха записани 18 пациенти.

За да се подчертае възможна връзка с клетките на имунитета и да се изключат дефектите в чревната абсорбция и/или метаболитните нарушения, концентрацията на витамин D3 е свързана с общите бели кръвни клетки (WBC), неутрофилите (N), лимфоцитите (L), желязото, феритин, трансферин, холестерол и гликемия (Таблица 1). Всички пациенти са имали нормални нива на феритин, трансферин и гликемия и само 3 пациенти са показали ниски нива на желязо и 1 пациент ниско ниво на холестерол, без промени в витамин D.

От 18 пациенти, 13 са показали нормални нива на витамин D3, между 16 и 60 ng/mL [28] (група А), а 5 пациенти са с дефицит на витамин D3. Избрахме да разделим пациентите с ниски нива на витамин D3 на 2 групи: пациенти с 10-16 ng/mL витамин D3 (група В, пациенти 1, 5 и 6) и пациенти с 1-4 ng/mL (група С, пациенти 13, 16).

Пациентите от групи А и В не показват промени в WBC; само пациент n. 2 представя намаляване на N и увеличаване на L като знак за възможно хронично възпаление (Таблица 1). Интересното е, че пациентите от група С имат ниско ниво на общ WBC, пациент 13 с ниско ниво на N (1,59 × 10 3) и пациент 16 с ниско ниво на L (0,71 × 10 3). Следователно тези данни могат да предполагат съществуването на връзка между ниското ниво на витамин D3 и нарушенията на левкоцита.

Важно е да се отбележи, че не е имало връзка между концентрацията на витамин D3 и възрастта. Всъщност от 18 пациенти е установено, че 10 са на възраст от 10 до 20 години, 2 от 21 до 30 години, 2 от 31 до 40 години и 2 от 41 до 50 години и за 1 пациент е установено, че има възраст от 51 до 61 години и 1 от 61 до 70 години (Фигура 1 (а)). Пациентите с ниска концентрация на витамин D3 са имали 16, 40 и 55 години, а пациентите с много ниско ниво на витамин D3 са имали 29 и 44 години (Фигура 1 (а)).