Присъединителен колеж по животновъдни науки и технологии и Ключова лаборатория за трева и тревопасни животни от Чунцин, Югозападния университет, Бейбей, Чунцин, Китай

предизвикана

Присъединителен колеж по животновъдни науки и технологии и Ключова лаборатория за трева и тревопасни животни от Чунцин, Югозападния университет, Бейбей, Чунцин, Китай

Affiliation College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia, China

Присъединителен колеж по животновъдни науки и технологии и Ключова лаборатория за трева и тревопасни животни от Чунцин, Югозападния университет, Бейбей, Чунцин, Китай

Affiliation College of Animal Science, Вътрешна Монголия, Аграрен университет, Hohhot, Вътрешна Монголия, Китай

Присъединителен колеж по животновъдни науки и технологии и Ключова лаборатория за трева и тревопасни животни от Чунцин, Югозападния университет, Бейбей, Чунцин, Китай

Присъединителен колеж по животновъдни науки и технологии и Ключова лаборатория за трева и тревопасни животни от Чунцин, Югозападния университет, Бейбей, Чунцин, Китай

Присъединителен колеж по животновъдни науки и технологии и Ключова лаборатория за трева и тревопасни животни от Чунцин, Югозападния университет, Бейбей, Чунцин, Китай

  • Guozhong Dong,
  • Мин Киу,
  • Чанджин Ао,
  • Джун Джоу,
  • Khas-Erdene,
  • Си Уанг,
  • Жу Джан,
  • Ти Ян

Фигури

Резюме

Предназначение

Целта на това проучване е да се изследват ефектите от храненето на диета с висока концентрация на царевична слама (HCS) (65% концентрат + 35% царевична слама) върху епигенетичните промени в млечната тъкан на млечните крави в сравнение с нискоконцентрираната диета с царевична слама (LCS) (46% концентрат + 54% царевична слама) и с диета с нискоконцентриран смесен фураж (LMF) (46% концентрат + 54% смесен фураж).

Експериментален дизайн

Китайските крави Холщайн с многоплодна храна в средата на лактацията са били хранени с една от тези три диети в продължение на 6 седмици, по това време са били взети кръвни проби и проби от тъкани на млечната жлеза. Проби от млечна артериална и венозна кръв бяха анализирани за концентрации на липополизахарид (LPS), докато пробите от млечна тъкан бяха изследвани за ацетилиране на хистон Н3 и метилиране на специфични гени, свързани със синтеза на мазнини и протеини.

Резултати

Екстракцията на хистони и количественото определяне на ацетилирането на хистон Н3 разкрива, че ацетилирането е значително намалено при крави, хранени с HCS диета, в сравнение с крави, хранени с LCS диета. Кравите, хранени с HCS диета, са имали значително по-високи концентрации на LPS в артериалната кръв на млечната жлеза, в сравнение с кравите, хранени с LCS диета. Установихме, че степента на ацетилиране на хистон Н3 е в отрицателна корелация с концентрациите на LPS. Метилирането на стеароил-коензим А десатуразен ген, свързан със синтеза на млечна мазнина, се увеличава при крави, хранени с HCS диета. За разлика от това, метилирането на гена, кодиращ сигналния преобразувател и активатора на транскрипция 5А, е намалено при крави, хранени с HCS диета, което предполага, че храненето с диета с високо концентрат от царевична слама може да промени метилирането на специфични гени, участващи в синтеза на мазнини и протеини в млечна тъкан на млечни крави.

Заключения

Храненето с висококонцентрирана диета предизвиква епигенетични промени в млечните тъкани на млечните крави, вероятно чрез осъществяване на отделянето на различни количества LPS в кръвта на млечната жлеза.

Цитат: Dong G, Qiu M, Ao C, Zhou J, Khas-Erdene, Wang X, et al. (2014) Хранене на висококонцентрирана диета от царевичен слама, предизвикана от епигенетични промени в млечната тъкан на млечни крави. PLoS ONE 9 (9): e107659. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107659

Редактор: Зейн Андрюс, Университет Монаш, Австралия

Получено: 6 юни 2014 г .; Прието: 16 август 2014 г .; Публикувано: 15 септември 2014 г.

Наличност на данни: Авторите потвърждават, че всички данни, лежащи в основата на констатациите, са напълно достъпни без ограничения. Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Изследването е подкрепено със средства от Националната ключова програма за основни изследвания на Китай (№ 2011CB100803). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Епигенетиката се определя като изследване на наследствени промени в генната експресия, които са независими от ДНК последователността [1]. Основните епигенетични събития включват ацетилиране и метилиране на хистони, метилиране на ДНК и генна регулация чрез некодиращи РНК. Свързването на хистон с ДНК в еукариотното ядро ​​модифицира свойствата на ДНК. Различни модификации на хистон включват ацетилиране, метилиране, фосфорилиране и убиквитиниране [2]. Ацетилирането и метилирането на хистони Н3 и Н4, които се случват при остатъци от лизин или аргинин, са най-често срещаните и добре проучени модификации на хистон. ДНК метилирането се отнася до добавянето на метилова група към цитозиновите остатъци на ДНК матрицата, което се среща предимно в цитозин-фосфат-гуанин (CpG) динуклеотиди при бозайници [3]. Епигенетични модификации на хистони и ДНК възникват в отговор на фактори на околната среда. Диетата, токсините, замърсителите, болестите и други фактори на околната среда могат да окажат дълбоко въздействие върху генната експресия чрез епигенетична регулация. Потенциалът на епигенетичната регулация да повлияе на функцията на млечната жлеза при млечните крави се обръща внимание през последните години [4] [5].

В системите за производство на мляко говедата често се хранят с висококонцентрирана диета поради сезонна или регионална липса на качествен фуражен материал. Храненето на диети с млечни крави, които съдържат високи пропорции на концентрат за подпомагане на високото производство на мляко, е свързано с висока честота на подостра руминална ацидоза (SARA) [6] [7] [8]. SARA е храносмилателно разстройство, което представлява заплаха за здравето на кърмещите млечни крави и се превърна в най-важното метаболитно заболяване в производството на млечни продукти в света. Високата смилаемост на търбуха на повечето зърнени храни в концентратните смеси увеличава производството на летливи мастни киселини в червея и предизвиква съответно спадане на рН на търбуха [6] [9] [10], което може да доведе до промени в средата на търбуха, което води до промени в състава на микробиотата на рубца [11] [12] и натрупването на ендотоксин (липополизахарид; LPS), потенциално вреден компонент на клетъчната стена на грам-отрицателни бактерии [7] [13] [14]. LPS може да се транслокира в кръвния поток през епителната бариера на стомашно-чревния тракт [15] [16] [17], предизвиквайки възпалителни реакции при кравите [15] [18] [19].

LPS може също да предизвика вредни епигенетични промени в млечната тъкан на млечните крави. Въпреки това, връзката между LPS и епигенетичните промени в млечната тъкан на млечните крави по време на храненето с диети с високо съдържание на концентрат все още не е документирана. В допълнение, епигенетичният контрол на експресията на млечен ген чрез модифициране на хистон и метилиране на ДНК по време на хранене с висококонцентрирани диети на млечни крави са неизвестни. В много страни царевичната слама често се използва в диетата на кравите поради липса на качествени груби фуражи, изискващи увеличаване на дела на концентрата в диетата, за да отговори на хранителните изисквания за лактация. Ние предположихме, че увеличаването на концентрацията на концентрат в диета на основата на царевична слама ще доведе до повишено навлизане на ендотоксин в млечната жлеза и по този начин ще предизвика епигенетични промени във вимето, което може да окаже неблагоприятен ефект върху експресията на млечния ген. Следователно целта на това проучване е да се оценят ефектите от храненето на диета с високо концентрирана царевична слама (HCS) върху епигенетичните промени в млечната тъкан на млечните крави в сравнение с диетата с ниска концентрация на царевична слама (LCS) и нискоконцентрирана диета със смесено качество на фураж (LMF).

Материали и методи

Декларация за етика

Изследването е одобрено от Комитета по етика на животните към Югозападния университет и всички експериментални процедури и грижите за животните са били в строго съответствие с „Насоките за етично третиране на опитни животни (2006, № 398)“, издадени от Министерството на науката и технология на Китай. Вземането на проби от кръв и млечна тъкан, описани подробно по-долу, се извършва под обща или регионална анестезия, за да се сведе до минимум страданието и болката при животните.

Животни, диети и експериментална процедура

Вземане на кръв и анализ

Вземане на проби и анализ на млечната тъкан

Проби от тъкани на млечната жлеза са получени чрез ударна биопсия съгласно Baumgard et al. [21] с модификации. Кравите бяха ограничени от движение под обща анестезия. Млечната жлеза беше изложена и 20 ml прокаин хидрохлорид бяха приложени в кръгова форма около мястото на разреза. След срязване и дезинфекция беше направен 5–6 cm разрез на кожата в средата на задната четвърт на дясната млечна жлеза. Съединителната тъкан се дисектира, за да се разкрие капсулата на жлезата и се получава биопсия на млечната тъкан (~ 500 mg) и се разделя наполовина. Едната половина от пробата се използва в анализи за ацетилиране на хистон Н3, докато другата се използва в анализи за метилиране на ДНК. Всички проби веднага се съхраняват в течен азот. След като беше направено вземане на проби от млечна тъкан, капсулата на жлезата, съединителната тъкан и кожата бяха зашити и животните получиха интрамускулен пеницилин за предотвратяване на инфекции.

Общо хистони бяха извлечени с помощта на EpiQuik ™ Total Histone Extraction Kit (Epigentek Group Inc.) съгласно протоколите на производителя. Количествено се определя ацетилирането на хистон Н3 с помощта на комплекта за анализ на ацетилиране EpiSeeker Histone H3 (Abcam). Местата на ацетилиране на хистон Н3 бяха идентифицирани чрез отделяне на хистон Н3 с помощта на електрофореза с натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел и оцветяване с брилянтно синьо в Coomassie. Хистоновата Н3 лента беше изрязана и обезцветена с 50% ацетонитрил + 25 тМ амониев бикарбонат. Хистон НЗ се усвоява с трипсин и пептидите се анализират с помощта на течна хроматография-масспектрометрия (MS) × MS (Thermo Scientific Inc.). Пептидните мас спектри бяха измерени и анализирани, за да се определят местата на ацетилиране с помощта на софтуера Mascot, като специално внимание беше отделено на откриването на йони със съотношение маса-заряд (m/z) от 126,1, което е диагностично за ацетилиране на лизин [22]. Лизин-ацетилираните пептиди също бяха потвърдени чрез откриване на масови разлики от 170 Da между съседни b-йони или y-йони.

Общата ДНК от млечната тъкан се извлича с помощта на реактивен комплект (Tiangen, Пекин, Китай) и се използва в анализи на ДНК метилиране на специфични гени чрез PCR за последователност на бисулфит (BSP). ДНК първо се третира с бисулфат, за да превърне неметилираните цитозини в урацили чрез дезаминиране, докато метилираните цитозини остават непроменени по време на лечението. По време на PCR урацилите се превръщат в тимини. PCR праймерите са проектирани с използване на Methyl Primer Express v1.0 (Таблица 2). PCR продуктите бяха клонирани и секвенирани, за да се определят нивата на метилиране на ДНК на специфични гени, използвайки софтуера BiQ Analyzer.

статистически анализи

При анализа на данните беше използван общия линеен модел (GLM) на SPSS (v.18). GLM включваше случаен ефект на кравата и фиксиран ефект от диетите, а средните разлики за всички променливи бяха разделени и сравнени, използвайки процедурата за многократно сравнение на Дънкан. Данните са представени като средни стойности ± стандартно отклонение. Значимостта, декларирана при p 2, се изчислява и използва за оценка на доброто състояние на напасването.

Резултати

Ние се интересувахме от определянето на въздействието на храненето с HCS диетата върху епигенетичните промени в млечната тъкан на млечните крави в сравнение с LCS диетата и LMF диетата. Първо анализирахме ефекта от тези диети върху количеството ацетилиране на хистон Н3 в тъканите на млечната жлеза. Екстракция на хистони и количествено определяне на ацетилиране на хистон Н3 разкрива, че ацетилирането е значително намалено при крави, хранени с HCS диета, в сравнение с крави, хранени с LCS диета (фигура 1). Тези данни предполагат, че диетата с висок концентрат може да предизвика епигенетични промени в тъканите на млечната жлеза.

Степента на ацетилиране на хистон Н3 в млечните жлези на млечните крави е количествено определена с помощта на EpiSeeker Histone H3 Acetylation Kit. Данните представляват средното и стандартното отклонение (n = 10/група), а звездичката показва статистическа разлика (p Фигура 2. Масови спектри на хистон Н3 лизин-ацетилирани пептиди, идентифицирани с помощта на масспектрометрия.

A. MS/MS спектри от m/z йон 882.4923. Б. MS/MS спектри от m/z йон 1376.6936.

Отличителна черта на храненето с висококонцентрирани диети на говедата е развитието на SARA [8] [16] [17], което често води до натрупване на LPS в кръвта, с последващо възпаление [15]. За да определим дали различните диети повлияват освобождаването на LPS, ние определихме количествено LPS в пробите от плазмата на млечната артерия и вените. Кравите, хранени с HCS диета, са имали значително по-високи концентрации на LPS в кръвта, в сравнение с кравите, хранени с LCS диета (фигура 3).

Концентрациите на LPS се определят количествено чрез хромогенен анализ на крайната точка, като се използва комплектът за реактивен тест за limulus amebocyte lysate (LAL). Данните представляват средното и стандартното отклонение (n = 10/група), а звездичката показва статистическа разлика (p Фигура 4. Връзка между съдържанието на LPS в плазмата на млечната артерия и нивата на ацетилиране на хистон H3).

Степента на ацетилиране на хистон Н3 в проби от млечна тъкан е начертана спрямо LPS концентрациите на плазмените проби на млечната артерия.

Степента на метилиране на ДНК на специфични гени, участващи в метаболизма на мазнините и протеините в млечната жлеза, беше оценена с помощта на BSP. Метилирането на гена SCD, кодиращ стеароил-коензим А дезатураза, свързана със синтеза на млечна мазнина, беше увеличено при крави, хранени с HCS диета, в сравнение с крави, хранени или с LCS или LMF диети (фигура 5). За разлика от това, метилирането на STAT5A, кодиращо сигналния преобразувател и активатора на транскрипция 5А, участващи в синтеза на протеини, е намалено при крави, хранени с HCS диета (фигура 5).

Тематични области

За повече информация относно предметните области на PLOS кликнете тук.

Искаме вашите отзиви. Имат ли смисъл тези предметни области за тази статия? Щракнете върху целта до неправилната тема и ни уведомете. Благодаря за вашата помощ!

Е тематичната област "Диета" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Хистони" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Ацетилиране" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "ДНК метилиране" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Царевица" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Мляко" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Епигенетика" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Протеинов синтез" приложим за тази статия? да не