Доказано е, че тясно свързани щамове на Escherichia coli причиняват екстраинтестинални инфекции при несвързани лица. Това проучване проверява дали може да съществува резервоар за храна за тези Е. coli. Бяха сравнени изолатите от 3 източника за същия период от време (2005–2007 г.) и географския район. Източниците включват проспективно събрани изолати на Е. coli от жени с инфекция на пикочните пътища (UTI) (n = 353); месо на дребно (n = 417); и ресторант/готови за консумация храни (n = 74). Е. coli бяха оценени за чувствителност към антимикробни лекарства и серотип O: H и сравнени чрез използване на 4 различни метода за генотипиране. Идентифицирахме 17 клонални групи, които съдържаха изолати на Е. coli (n = 72) от> 1 източник. Е. coli от пилешко месо на дребно (O25: H4-ST131 и O114: H4-ST117) и пъпеш от медена роса (O2: H7-ST95) не се различават от E. coli от човешки UTI. Това проучване осигурява силна подкрепа за ролята на резервоарите за храна или пренасянето им с храна при разпространението на Е. coli, причиняващи често срещани инфекции, получени от общността.

ешерихия

Хранително предаване на извън чревна Е. coli е често срещано явление.

Екстраинтестиналните инфекции, причинени от Escherichia coli, причиняват сериозни заболявания и смърт. Всяка година в Съединените щати се случват 6–8 милиона случая на неусложнени инфекции на пикочните пътища (ИПП) и 130–175 милиона случая в световен мащаб; > 80% са свързани с Е. coli (1,2). Пикочните пътища са най-честият източник на Е. coli, причиняващи инфекции на кръвта, които причиняват 40 000 смъртни случая от сепсис всяка година в САЩ (1). Некомплицираните UTIs са отговорни за приблизително 1–2 милиарда щатски долара преки разходи за здравеопазване в Съединените щати годишно (1,2). Антимикробната лекарствена резистентност сред извън чревната Е. coli допълнително увеличава разходите за лечение на тези инфекции (3). Резистентните към лекарства инфекции често изискват по-сложни схеми на лечение и водят до повече неуспехи в лечението.

Непосредственият резервоар на Е. coli, който причинява екстраинтестинални инфекции, е чревният тракт на човека. Въпреки че извън чревните инфекции, причинени от Е. coli, обикновено не са свързани с огнища, нарастващите доказателства показват, че извън чревната Е. coli може да е отговорна за епидемиите в цялата общност. Например през 2001 г. съобщихме за откриването на E. coli O11/O77/O17/O73: K52: H18-ST69. Тази клонална група причинява 11% от всички инфекции на пикочните пътища на E. coli и 49% от всички устойчиви на триметоприм/сулфаметоксазол инфекции на инфекции на E. coli в 1 калифорнийска общност за период от 4 месеца (4). Той причини антимикробни устойчиви на лекарства ИПП в Мичиган, Минесота и Колорадо (5) и пиелонефрит в няколко държави (6). Описани са и други огнища на инфекции на пикочните пътища, причинени от Е. coli, включително голямо огнище на Е. coli O15: K52: H1 в Южен Лондон (7), групи от случаи в Копенхаген, Дания, причинени от E. coli O78: H10 (8 ) и случаи в Калгари, Алберта, Канада, причинени от E. coli, продуциращ β-лактамаза с разширен спектър (9).

Идентифицирането на тези огнища на щамове предполага, че източниците от околната среда, евентуално замърсено месо и други храни, могат да играят роля в местното разпространение на тясно свързани щамове на Е. coli. Ако има хранителен резервоар за животни за извън чревна Е. coli, тогава използването на антимикробни агенти в производството на храни за животни може да избере за антимикробни лекарствени резистентни форми на екстраинтестинална Е. coli (10,11). Наблюдавани са връзки между антимикробната резистентност и специфичните щамове на извън чревната Е. coli в животински хранителни продукти, по-специално пилешко месо, и човешки инфекции (12-16). В предишно проучване ние отбелязахме увеличаване на антимикробните устойчиви на лекарства UTI сред жени, които съобщават за честа консумация на пилешко и свинско месо (17).

Доказателствата, показващи, че храната може да бъде резервоар за извън чревна Е. coli, включват 1) огнища на извън чревни инфекции, причинени от епидемични щамове на Е. coli, причиняващи неусложнени ИМП (4,18) и други тежки инфекции (6,19,20); 2) определянето, че тези епидемични щамове споделят антимикробни модели на чувствителност към лекарства и генотипове с изолати от месо на дребно (12–15); и 3) епидемиологичната връзка между консумацията на месо на дребно и чревното придобиване на устойчиви на антимикробни лекарства E. coli, причиняващи ИМП (17). Въз основа на тези наблюдения, ние предполагаме, че пилешкото месо на дребно е основният резервоар за Е. coli, причиняващ екстраинтестинални инфекции при човека.

Методи

Уча дизайн

Изолатите на Е. coli от клинични проби от хора, ресторантски/готови за консумация храни и месо на дребно се вземат систематично за същия период. Човешки клинични изолати и ресторанти/готови за консумация изолати са получени от Монреал, Квебек, Канада. Включени са изолатите за месо на дребно от Квебек и Онтарио, тъй като жените с инфекции са предимно от тези региони. Надявахме се да максимизираме вероятността за съвпадение на генотипове между Е. coli от тези 3 източника. Изолатите на Е. coli от всеки източник се култивират и обработват отделно, за да се предотврати кръстосано замърсяване. Протоколът за изследването е одобрен от Институционалния съвет за преглед на университета Макгил (A01-M04-05A).

Вземане на проби от E. coli, причиняващи човешки инфекции на пикочните пътища
Вземане на проби от E. coli от месо на дребно
Вземане на проби от E. coli от ресторантски/готови за консумация хранителни източници

Включихме всичките 74 изолати на Е. coli от ресторанти и готови за консумация хранителни източници за Монреал, събрани от 1 януари 2005 г. до 31 декември 2007 г., от Division de l’Inspection des Aliments (24,25). Тези изолати бяха възстановени от редица готови и готови за консумация храни, включително месо, плодове, зеленчуци и други продукти. Изолатите бяха събрани като част от рутинни дейности по наблюдение и от проверки, свързани с оплаквания на ресторанти и заведения, предлагащи готови храни.

Чувствителност към антимикробни лекарства

Определихме минималните стойности на инхибиторна концентрация за 15 антимикробни агента за всички изолати на Е. coli чрез метода на микроразреждане с бульон (26), като използвахме автоматизираната микробиологична система Sensititre (Trek Diagnostic Systems Ltd., Cleveland, OH, USA). За тестване на Е. coli е използван панел за чувствителност CMV1AGNF на Националната система за мониторинг на антимикробната резистентност (NARMS). Човешките клинични и ресторантски/готови за консумация изолати също са оценени за устойчивост към цефалотин и нитрофурантоин чрез стандартен дисков дифузионен метод (27). Изолатите са определени като устойчиви, междинни или податливи съгласно Института за клинични и лабораторни стандарти и насоките на NARMS (23). Изолатите, проявяващи междинна резистентност, бяха интерпретирани като податливи.

Анализ на повторение на двойно променливо число с тандем

Проведохме мултилокусен анализ на тандем с повторно число (MLVA) на всички изолати, използвайки капилярни методи за електрофореза, както е описано по-рано в Manges et al (28). По същество, 8 локуса бяха амплифицирани в отделни PCRs чрез използване на флуоресцентни праймери. Дължините на необработените фрагменти за всеки локус бяха ръчно изсечени, като се използва минимален праг от ± 3 bp, за да се разграничат алелите. E. coli CFT073, K12 и O157: H7 бяха използвани като положителни контроли. Наборът от 8 алела за всеки изолат се дефинира като MLVA профил.

Ентеробактериална повтаряща се интергенна консенсусна последователност 2 PCR пръстови отпечатъци

Изолатите на E. coli, показващи неразличими MLVA профили, бяха сравнени чрез ентеробактериални повтарящи се интергенни консенсусни последователности 2 PCR (ERIC2 PCR) отпечатъци (29). Изолатите с пръстови отпечатъци, които не се различават при визуална проверка, бяха групирани и избрани за по-нататъшно писане.

Определение на клонална група

Клоналната група беше дефинирана като> 2 изолати на E. coli, показващи неразличими MLVA и ERIC2 PCR модели. Ние се фокусирахме само върху групи, идентифицирани от MLVA и ERIC2 PCR, които съдържаха членове от> 1 източник. Включени бяха групи, съдържащи изолати от месо на дребно и източници на храни/готови за консумация храни, за да се определи дали в приготвената храна могат да бъдат идентифицирани свързани извън чревни E. coli от месо изолати на дребно. Тези групи получиха обозначение, което включваше типа на серогрупата и мултилокусната последователност (MLST), както в серогрупата O25: H4 и ST131 (O25: H4-ST131). Избрани изолати, представляващи всяка клонова група, бяха избрани и оценени чрез гел електрофореза с импулсно поле (PFGE), серотипиране, MLST и филогенетично типизиране, за да се потвърди идентичността на тези клонални групи и да се определи тяхната вътрешногрупова вариабилност.

Електрофореза с импулсно поле

Използвани са стандартните центрове за контрол и профилактика на заболяванията за молекулярно подтипиране на E. coli O157: H7 от PFGE (30). PFGE на XbaI- и NotI-усвоена ДНК се извършва върху избрани изолати, принадлежащи към всяка клонална група. Изолатите, показващи идентични модели на PFGE, се считат за генетично неразличими, тези, показващи 1–3 лентови разлики, се считат за тясно свързани, а тези, показващи 4–6 лентови разлики, се считат за евентуално свързани (31).

Серотипиране

Агенцията за обществено здраве на Канада Лаборатория за хранителни зоонози извърши O- и H-серотипиране, използвайки установени протоколи. Изолатите, които не са реагирали с О антисерум, са класифицирани като нетипируеми (ONT), а тези, които са неподвижни, са обозначени като NM.

MLST и филотипиране

MLST на избрани изолати на Е. coli се извършва, както е описано по-горе (32). Амплификацията на гени и секвенирането бяха извършени чрез използване на праймерите, посочени в уебсайта на E. coli MLST (http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli). Определянето на алелен профил и тип последователност е възложено съгласно схемата на този уебсайт. Определянето на основните филогенетични групи на E. coli (A, B1, B2 и D) се извършва чрез мултиплекс PCR (33).

Статистически анализи

Изчислени са пропорции и 95% доверителни интервали за пропорции. Разликите в пропорциите се оценяват с х 2 теста; статистическата значимост се определя като р стойност

Група 2 съдържа E. coli, характеризираща се като O2: H7-ST95; един изолат е от ресторант/готов за консумация източник на храна (пъпеш от медена роса), а 8 изолата са от случаи на човешка инфекция. Моделите на XbaI PFGE бяха неразличими за 3 от изолатите на човешка инфекция (MSHS 100, 186 и 811) и изолата за ресторант/готова за консумация храна (68616.01); другите изолати 5 O2: H7-ST95 се различават с 1 лента (MSHS 1229), две ленти (MSHS 95 и MSHS 1062) и 4 ленти (MSHS 782 и MSHS 819) от изолата на източника на храна, съответно (Фигура 1, панел А). Моделите NotI PFGE за MSHS 100 и MSHS 186 бяха неразличими от ресторанта/готовия за консумация изолат, а другите изолати на човешка инфекция се различаваха с 1 до 7 ленти (Фигура 1, панел Б). Изолатът на Е. coli от източника на храна е напълно чувствителен, както и повечето изолати от човешките инфекции, с изключение на 2 (единият е устойчив на ампицилин, а вторият на ампицилин, сулфизоксазол и триметоприм/сулфаметоксазол).

Фигура 2. XbaI и NotI модели на гел електрофореза с импулсно поле за Escherichia coli O114: H4-ST117 (линии 2 и 3). Линия 1 е положителната контрола E. coli O11: H18-ST69 (SEQ102), лента 2 е E. coli.

Група 3 съдържа E. coli, характеризирана като O114: H4-ST117; единият изолат е от пилешко месо на дребно, а вторият е от човешки ИМП. Моделите XbaI PFGE на изолата от човешка инфекция (MSHS 1014A) и изолата от месо на дребно (EC01DT05-0789-01) се различават с 5 ленти (Фигура 2). Моделите NotI PFGE се различават с> 6 ленти (Фигура 2). И двата изолата бяха напълно податливи. В допълнение към споделените модели на PFGE, тези 3 групи от Е. coli споделят едни и същи MLST, серотипове и филотипове.

Клоналната група, характеризираща се като E. coli O17/O73/O77: H18-ST69, известна също като клонална група А (4), е идентифицирана в проби от месо от хора и дребно, въпреки че не са наблюдавани тясно свързани модели на PFGE (група 4, таблица 2). Три други групи (групи 5-7, таблица 2), характеризирани като Е. coli O4: H5-ST493, O36: NM-ST401 и O172: H16-ST295, показват общи MLST, серотипове и филотипове, но моделите PFGE не са свързани.

Дискусия

Ние докладваме за идентифицирането на изолатите на Е. coli от пилешкото месо на дребно и други източници на храна, които не се различават или са тясно свързани с изолатите от човешки пикочни пътища. Нашата априорна хипотеза, базирана на резултати от предишни проучвания, предполага, че месото на дребно, по-специално пилешкото месо, може да бъде резервоар за Е. coli, причиняващ човешки извън чревни инфекции. Това проучване осигурява силна подкрепа за тази хипотеза въз основа на генетични прилики между храната и човешките клинични изолати.

Johnson et al. са предположили, че антимикробните устойчиви на лекарства Е. coli от човешки изпражнения (и инфекции на човешкия кръвен поток) са по-сходни с устойчивите на антимикробни и чувствителни Е. coli от източници на птиче месо на дребно (14,15). Тези наблюдения показват, че селекцията на устойчиви E. coli е по-вероятно да се случи в резервоара за животинска храна, отколкото при хората. В това проучване ние забелязахме, че генетично свързаните Е. coli от хранителни източници и човешки инфекции са склонни да бъдат податливи, което предполага, че както устойчивите, така и чувствителните изолати, причиняващи UTI при жените, могат да се предават чрез доставката на храна. Нашето проучване също така идентифицира членове на групата O2: H7-ST95, по-рано асоциирана с екстраинтестинални заболявания както при хора, така и при птици гостоприемници (34). Изолатът на източник на храна O2: H7-ST95 от това проучване е от пъпеш от медена роса. Потенциалният произход на това замърсяване с Е. coli може да включва човешки или хранителни животински източници.

Клоновата група на E. coli O25: H4-ST131, също идентифицирана в това проучване, е свързана с производството на β-лактамаза с разширен спектър и резистентност към флуорохинолон и е открита в цяла Европа и в Канада (18,35–37). Изолираните E. coli O25: H4-ST131, идентифицирани в това проучване, са податливи; тъй като тази клонова група може да бъде намерена в резервоар за хранителни животни и да се предава чрез храна, усилването и предаването на тези силно устойчиви организми може да бъде възможно. Разширеният спектър на продуциране на β-лактамаза E. coli все още не е идентифициран от CIPARS (23,38,39).

Идентифицирането на 2 клонални групи, съдържащи изолати от пилешко месо на дребно и човешки инфекции, подкрепя нашата априорна хипотеза. Не можем да изключим възможността изолатите на източници на храна да са присъствали поради човешко замърсяване по време на производството, преработката или обработката на храни, въпреки че е много малко вероятно. Последващите изследвания ще помогнат да се определи дали тези Е. coli се срещат в резервоар за храни с животни или дали пренасянето на тези Е. coli е резултат от замърсяване по време на преработката или приготвянето на храна и отразява предаването от човек на човек чрез храна.

Това проучване показва, че някои Е. coli от пилешко месо на дребно и други хранителни източници са тясно свързани с E. coli, причиняващи човешки инфекции на пикочните пътища. Тъй като очевидно съществува резервоар за хранителни животни за Е. coli, които причиняват пикочни пътища и други екстраинтестинални инфекции, това допълнително засилва необходимостта от отговорно управление на антимикробните лекарства във ветеринарната медицина и производството на животни, както и в хуманната медицина.

Г-жа Винсент е аспирант в катедрата по микробиология и имунология в университета Макгил в Монреал, Квебек. Нейните изследователски интереси включват бактериология и молекулярна епидемиология и в момента тя разследва възможната хранителна трансмисия на E. coli, причиняваща инфекции на пикочните пътища.

Благодарности

Благодарим на членовете на екипа за наблюдение на Канадската интегрирана програма за наблюдение на антимикробната резистентност (Brent Avery); дивизията de l’Inspection des Aliments, Ville de Montréal (Myrto Mantzavrakos и Annie Laviolette); и Кристиан Лакомб, клиничен техник на студентските здравни служби.