Роли Концептуализация, официален анализ, разследване, методология, писане - оригинален проект

слюнката

Катедра по хранителна химия, Technische Universität Dresden, Дрезден, Германия

Роли Концептуализация, администриране на проекти, надзор, писане - преглед и редактиране

Катедра по хранителна химия, Technische Universität Dresden, Дрезден, Германия

Роли Формален анализ, разследване

Катедра по хранителна химия, Technische Universität Dresden, Дрезден, Германия

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, администриране на проекти, надзор, писане - преглед и редактиране

Катедра по хранителна химия, Technische Universität Dresden, Дрезден, Германия

  • Фридерике Маниг,
  • Майкъл Хелуиг,
  • Франциска Пиц,
  • Томас Хенле

Фигури

Резюме

Цитат: Manig F, Hellwig M, Pietz F, Henle T (2019) Количество на свободните гликационни съединения в слюнката. PLoS ONE 14 (9): e0220208. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220208

Редактор: Ghulam Md Ashraf, Университет Крал Абдулазиз, Саудитска Арабия

Получено: 3 април 2019 г .; Прието: 10 юли 2019 г .; Публикувано: 18 септември 2019 г.

Наличност на данни: Всички съответни сурови данни дори бяха качени с помощта на хранилището за отворен достъп и архива OpARA тук: https://opara.zih.tu-dresden.de/xmlui/handle/123456789/1416.

Финансиране: Данните бяха генерирани като част от европейския проект SALIVAGES. Инициативата за съвместна програма (JPI) подкрепя консорциума SALIVAGES в рамките на програмата „Здравословна диета за здравословен живот“ (HDHL). Авторите признават Германското федерално министерство за научни изследвания и образование (BMBF) за подкрепа на проекта за FM (грант номер 01EA1703). Финансистът няма роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Съкращения: 3-DG, 3-дезоксиглюкозон; ВЪЗРАСТ (и), краен продукт (и) за гликиране; AP (s), Amadori продукт (и); Арг, аргинин; CEL, Nε-карбоксиетилилизин; CML, Nε-карбоксиметиллизин; FruLys, N ε -фруктозилизин; HPLC, течна хроматография под високо налягане; LC-MS, течна хроматохрафия, съчетана с мас спектрометрия; Lys, лизин; MG-H1, хидроимидазолон 1, получен от метилглиоксал; MGO, метилглиоксал; MRP (s), Продукт (и) за реакция на Maillard; NFPA, нонафлуоропентанова киселина; Пир, Пиралин

Въведение

Дневният прием на MRP е изчислен след цялостен анализ на различни хранителни продукти с 3,1 ± 1,0 mg CML (

0,015 mmol), 2,3 ± 0,8 mg CEL (

0,01 mmol) и 21,7 ± 6,7 mg MG-H1 (

0,1 mmol) [18]. Pyr като най-важният хранителен MRP се оценява с прием от 20 до 40 mg (

0,08–0,16 mmol) [19]. След поглъщане гликираните протеини се подлагат на протеолитично разцепване [20–22]. Транслокацията на получените пептиди и аминокиселини зависи от химическата природа на MRP. Изследванията на потока in vitro върху клетки Caco-2 предполагат трансфер през базолатералната мембрана за MRPs с неполярна странична верига като Pyr, но не и за молекули със заредена странична верига като CML [23,24]. При проучвания с човешки доброволци е установено ниско възстановяване на FruLys в урината и изпражненията, но високо възстановяване на Pyr в урината, което показва усвояването на Pyr, но не и на FruLys [25–27]. Широка гама от безплатни MRP, като CML, CEL, MG-H1 и др., Бяха изчислени в човешката плазма в наномоларен диапазон [11].

По принцип аминокиселините могат да се определят количествено в потта и слюнката [35,46,47]. Това повдига въпроса дали MRP се откриват в човешката слюнка или не. Целта на това проучване беше да се създаде мултиметод LC-MS/MS и да се изследва слюнченият “AGEome” по отношение на AGEs CML, CEL, MG-H1, Pyr, както и AP FruLys с хомогенна група субекти.

материали и методи

Химикали

LC-MS клас ацетонитрил и HPLC клас метанол са закупени от VWR Prolabo (Дармщат, Германия). Двойно дестилирана вода (Bi 18E система за двойна дестилация, QCS, Maintal, Германия) беше използвана за разтворители за LC-MS анализ, а нонафлуоропентанова киселина (NFPA) беше от Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия). Референтен материал за калибриране е синтезиран, както е описано по-горе: N ε-фруктозилизин [48], пиралин [24,49], CML [23], CEL [23] и MG-H1 [23]. Стабилни изотопно маркирани вътрешни стандарти за HPLC-MS/MS анализ са синтезирани по същия начин, но с използване на [13 C6, 15 N2] лизин ([13 C6, 15 N2] Pyr) и [13 C6] аргинин ([13 C6] MG -H1) вместо немаркираните съединения. [13 СЗ] CEL се синтезира, както е описано по-долу. [2 H2] CML е получен от PolyPeptide (Страсбург, Франция), [13 C6, 15 N2] лизин и [13 C3] натриев пируват от Campro (Берлин, Германия) и [13 C6] аргинин от Eurisotop (Saarbrücken, Германия) . Пречистването се извършва чрез полупрепаративна йонообменна хроматография и чистотата и идентичността на продуктите се оценяват с ядрено-магнитен резонансен спектроскоп, масспектрометрия и анализ на аминокиселини.

Синтез на [13 C3] N ε-карбоксиетилилизин

Аналитични данни: HPLC-MS/MS: tR, 8.4 минути; фрагментация (100 V, 10 eV) от [M + H] + (m/z 222), 130 (100), 84 (91), 222 (24), 175 (5), 159 (4). Съдържание = 76,2%, въз основа на калибриране с немаркиран стандарт. Добив: 43,5 mg (59,7%).

Уча дизайн

Изследването е одобрено от Комитета по етика на Technische Universität Dresden, Германия (справка: AZ 439112017). Писмено съгласие е получено от всеки участник в проучването. Общо проучването включва 55 участници, от които 22 субекта трябва да бъдат изключени най-вече поради ниски количества слюнка. Нивата на слюнчените MRP на гладно са анализирани в два екземпляра в проби от 33 метаболитно здрави индивида. Всеки ден преди закуска се взема проба от слюнка. За да се изследва предполагаемото диетично въздействие върху нивата на слюнчените MRP, шестима субекти бяха помолени да ядат незагрята храна, на практика без MRP [51] (главно зеленчуци, плодове, непечени ядки) в продължение на два дни. Вземането на проби се извършва на първия ден до третия ден сутринта. Същата група субекти събират проби в продължение на още три дни, докато ядат обичайните си диети, включително богата на MRP храна.

Вземане на проби

Събирането на слюнка на гладно се извършва в 8 часа сутринта със Salivettes (Sarstedt, Германия). Протоколът на производителя за вземане на проби е адаптиран да използва Salivettes за събиране на слюнка без стимулация. Субектите бяха помолени да измият зъбите без паста за зъби, да изплакнат устата с вода и да изчакат пет минути. Саливетите бяха поставени в средата на езика. Субектите бяха помолени да не мърдат езика в рамките на три минути след събирането на слюнка.

Подготовка на проби от слюнка за MRP анализ

Слюнката се изолира от Salivettes чрез центрофугиране (2 минути, 2500 g). 500 μl слюнка се смесва с 10 μl вътрешен стандартен разтвор, както и 490 μl леденостуден ацетонитрил/метанол (70/30, v/v). След 10 минути при 4 ° С епруветките се центрофугират (10000 g, 10 минути), супернатантата се изпарява под азот до сухо и остатъкът се разтваря отново в 90 μL 20 mM NFPA. Обикновено пробите се анализират в два екземпляра. Като основа за заготовки се използва двойно дестилирана вода. По време на обработката на пробите заготовките бяха третирани като проби. Разтворите за външно калибриране на CML, CEL, MG-H1, Pyr, FruLys, както и Arg и Lys с всеки от съответния вътрешен стандарт на изотополог, също се изпаряват под азот до сухо и се разтварят в 20 mM NFPA. Кривата на калибриране за MRP е линейна между 0,003–0,15 ng/ml и за аминокиселини между 0,1–150 μg/ml.

Течна хроматография под високо налягане с тандемна масспектрометрична детекция (HPLC-MS/MS)

Безплатните MRP бяха изчислени на HPLC-MS/MS система, състояща се от двоична помпа (G1312A), онлайн дегазатор (G1379B), автосамплер (G1329A), термостат на колона (G1316A), детектор на диодна решетка (G1315D) и масов спектрометър с троен квадрупол (G6410A; всички от Agilent Technologies, Böblingen, Германия). Азотът беше използван като пулверизиращ газ при източника на ESI с газов поток от 11 L/min, температура на газа от 350 ° C и налягане на пулверизатора от 35 psi, а капилярното напрежение беше 4000 V. Пробите бяха проведени на Phenomenex Kinetex C-18 колона (50 х 2.1 mm, 1.7 μm, 100 Å) и инжекционен обем от 5 μL се използва за хроматографско разделяне. Разтворител А се състои от 10 тМ NFPA във вода, разтворител В е 10 тМ NFPA в ацетонитрил. Използва се градиент (0 min, 5% B; 10 min, 32% B; 11 min, 85% B; 14 min, 85% B; 15 min, 5% B) със скорост на потока от 0,25 ml/min. За събиране на данни е използван софтуерът Mass Hunter B.02.00 (Agilent). Количественото определяне беше извършено с помощта на MRM режим с йонни преходи, показани в Таблица 1. Всички проби бяха анализирани в два екземпляра.

Статистика и валидиране на методите

Всеки отделен аналит (сив) е анализиран в съответствие със съответния вътрешен стандарт на изотополога (черен) чрез специфични MRM преходи.

Изчисляването на границата на откриване (LOD) и границата на количествено определяне (LOQ) се основава на метода на калибрационната крива, като се използва калибровъчната крива за всеки аналит. Обхватът на концентрациите, обхванат от калибрирането, дава линейна сигнална реакция с коефициенти на детерминация, съответно между 0,980 (MG-H1) и 0,999 (други анализи). Данните за валидиране са изброени в таблица 2. Съответните LOD и LOQ са в съгласие с данните, публикувани по-рано [11]. Изчислени са проценти на възстановяване между 72,7 и 110,3% за анализа със Salivettes. По време на нашето проучване установихме, че памукът от Salivettes задържа до 27% от аналита в случая на FruLys или дори е довел до по-високи добиви на аналити (CEL) на MRP в слюнката, най-вероятно поради обогатяване. Установено е, че повторяемостта за LC-MS измервания варира между 0,8% (Pyr) и 14,7% (MG-H1), изчисляват се повторяемости за подготовка на пробата между 1,4% и 16,3%.

Индивидуална вариация на нивата на MRP в слюнката

Квадратът показва средната стойност, линията показва средната стойност. CEL е открит в 26/99 проби; представените данни се отнасят до проби с пиково съотношение CEL S/N> 3.

За по-нататъшна оценка на връзките между появата на MRP, е направен корелационен анализ между отделните анализи в слюнката според моделите на Spearman (таблица S3). По отношение на MRPs се наблюдава умерена корелация за Pyr и CML с FruLys, както и Lys и FruLys. Интересното е, че това важи и за Lys и Arg, показвайки умерени корелации с повечето изследвани MRP. Това наблюдение може да се дължи на подобни механизми на транспорт на Arg и Lys от кръвта към слюнката, какъвто може да бъде случаят и с MRPs, произхождащи от Arg и Lys. CEL е единственият аналит, който не показва корелация с друго съединение, анализирано в това проучване.

Индивидуална вариация на нивата на MRP в слюнката

За да се оценят интраиндивидуалните вариации между различните дни на нивата на слюнчените MRP на всеки субект, субектите бяха помолени да дадат проби от три последователни дни. Пробите се измерват, както е посочено по-горе, и интраиндивидуалната вариация се изчислява като коефициент на вариация. Анализът разкрива високи интраиндивидуални вариации за FruLys, MG-H1, лизин и аргинин, вариращи между 5 и 80–90% (вж. Таблица 3 и S1 Фиг.). Забележително е, че FruLys показва високи, а Pyr ниски между- и интраиндивидуални вариации. Междуиндивидуалните вариации се припокриват междуиндивидуалните вариации. Профил на изследваните MRP от различни субекти е даден на фигура S1. Интраиндивидуалните вариации могат да бъдат обяснени с хранителен прием на MRP, поведение на тютюнопушенето, индивидуални метаболитни или дори патофизиологични характеристики. Описано е за няколко вещества, които слюнката отразява концентрацията в кръвта [31,32,44,56]. Това предположение се подкрепя от два аргумента: Силно зависимо от възрастта увеличение на MRPs в биологичните течности нито е наблюдавано в това проучване, нито е съобщено за изразено в литературата [57].

Предварително проучване относно въздействието на диетата

Нивата на слюнката на изследваните аналити показват високи между- и интраиндивидуални вариации, които не могат да бъдат обяснени с нито един от личните параметри, зададени във въпросника. Оценката на храненията, погълнати от участниците, както е съобщено във въпросника, предполага диетично влияние върху нивата на слюнчените MRP. За да се анализира дали концентрациите на отделни MRP в слюнката зависят от приема на диета, група доброволци, хомогенни по възраст и поведение при пушене (леки или непушачи), бяха помолени да ядат сурова или неотопляема храна в продължение на два дни. Снабдяването с протеини беше осигурено чрез ядене на непечени, незатоплени ядки (кашутата бяха изключени, тъй като кашуто може да се нагрее по време на белене и обработка) и приблизително. Фигура 3. Изследване на алиментарно въздействие върху слюнчените съединения на реакцията на Maillard.