1 School of Nutrition and Health Promotion, School of Life Sciences, Arizona State University, Темпе, AZ 85287, САЩ

прием

Резюме

1. Въведение

Понастоящем диабетът е водещата причина за 44% от новодиагностицираните случаи на бъбречна недостатъчност [1], тъй като трайната хипергликемия уврежда филтрационните мембрани на бъбреците, което води до албуминурия и протеинурия. Всъщност протеинурията често се използва като заместител на маркера за бъбречно заболяване [2–4]. Тъй като честотата на диабета продължава да се увеличава по целия свят, също се очаква да се увеличат нивата на албуминурия и диабетно бъбречно заболяване (DKD) [2].

Механизмите, водещи до развитието на хронично бъбречно заболяване (ХБН) при пациенти с метаболитен синдром, обаче не са толкова добре разбрани [5]. Според Световната здравна организация критериите за диагностициране на метаболитен синдром показват, че човек трябва да има инсулинова резистентност, диабет тип 2, нарушен глюкозен толеранс или нарушена глюкоза на гладно, заедно с два допълнителни критерия: абдоминално или цялостно затлъстяване, дислипидемия, хипертония или микроалбуминурия [6]. Тези характеристики на метаболитния синдром също увеличават риска от развитие на сърдечно-съдови заболявания и диабет, които впоследствие увеличават риска от бъбречна дисфункция и неуспех [6]. Фостър и сътр. [7] разгледа данните от проучването на Framingham Heart, което изследва връзката между натрупването на бъбречна мазнина, хипертонията и ХБН. Участниците бяха оценени за бъбречна мастна тъкан чрез компютърна томография. Идентифицирани са положителни връзки между затлъстяване на бъбреците и хипертония и между затлъстяване на бъбреците и ХБН. След коригиране на висцералната мастна тъкан не е открита връзка между инфилтрацията на мазнини в бъбреците и диабета. Тези данни показват, че може да има независима връзка между хипертонията, натрупването на мазнини в бъбреците и ХБН [7].

Deji et al. [5] показа, че храненето на 6-седмични мишки с диета с високо съдържание на мазнини (60% мазнини) в продължение на 12 седмици повишава телесната маса, плазмените глюкоза, инсулин и концентрации на триглицериди и предизвиква хипертония и бъбречни заболявания, както се доказва от повишена албуминурия, промени в бъбречна морфология и бъбречно натрупване на липиди. По същия начин Altunkaynak et al. [8] демонстрира, че храненето на възрастни женски плъхове Sprague-Dawley с умерена мастна диета (30% мазнини) в продължение на 12 седмици води до наднормено тегло на животните и до развитие на увеличени бъбречни маси и обеми със значителни морфологични промени, показателни за бъбречно заболяване. Освен това, бъбречното натрупване на мазнини е очевидно при дори умерен прием на мазнини при зайци (10% царевично масло + 5% свинска мас за 8–12 седмици) [9]. Stemmer et al. [10] сравнява слаби плъхове Wistar, хранени с чау, с плъхове, хранени с HFD, които са или чувствителни, или частично устойчиви на индуцирано от диетата затлъстяване след единадесет месеца HFD (40% маслена мазнина). Установена е положителна връзка между нивата на затлъстяване и тежестта на бъбречното увреждане. Техните резултати показват, че липотоксичността не допринася силно за бъбречната дисфункция, тъй като те установяват, че нивата на плазмените триглицериди и свободни мастни киселини, както и нивата на бъбречните триглицериди не се различават значително между лечебните и контролните групи [10].

2. Материали и методи

2.1. Модели на животни
2.2. Морфометрия

Измерва се морфометрия на животните (телесна маса, маса на епидидималната мастна тъкан, обиколка на талията и дължина на опашката) и маси на бъбречната тъкан. Дължината на опашката се използва като маркер за общия растеж при плъхове [15]. Епидидималната мастна подложка се използва за определяне на вариациите в затлъстяването между HFD и плъхове, хранени с чау, тъй като епидидималната мастна подложка може лесно да бъде отстранена обективно от животното. Освен това, скорошни проучвания показват, че тази мастна подложка е силно свързана

с общ обем мазнини от основата на черепа до дисталната част на пищяла, измерена по in vivo сканиране microCT [16].

Подмножество замразени бъбреци (

2.3. Биомаркери на бъбречната функция

Измерването на отделянето на общите протеини в урината, протеинурията, е маркер за ранно бъбречно заболяване [3, 4]. Всъщност многобройни проучвания са установили по-силна връзка между протеинурията и резултатите от бъбречно заболяване от всички други тествани фактори [4]. Освен това, клинични проучвания върху хора идентифицират протеинурията като един от първите клинични симптоми на бъбречно увреждане [17, 18]. Общите концентрации на протеини в урината бяха измерени на случаен набор (

/ група), използвайки техниката на Брадфорд (Кат. номер 500-0006; Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Концентрациите на креатинин в урината бяха измерени на същия набор от проби от урина (/ група), като се използва наличен комплект (Cat. Номер CR01; Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, MI) и бяха използвани стойности за изчисляване на съотношението протеин: креатинин. Интересното е, че креатининовият клирънс също корелира с риска от бъбречна недостатъчност [19].

Цистатин С, произведен от ядрени клетки, се филтрира от гломерула и след това се катаболизира от тубуларни клетки в бъбреците [20]. Поради тази причина плазмените концентрации на цистатин С могат да се използват като биомаркер на скоростта на гломерулна филтрация [20]. Промените в урината в цистатин С могат да се използват като маркери за остро бъбречно увреждане, въпреки че не често се използват при оценка на ХБН [21]. Концентрациите на серумен креатинин по същия начин често се оценяват като маркер на бъбречната функция; по-новите проучвания обаче показват, че серумният или плазменият цистатин С е по-силен и по-последователен сурогатен показател за скоростта на гломерулна филтрация и бъбречната функция [19–27]. Концентрациите на цистатин С в серума се увеличават до 1-2 дни преди серумния креатинин в условия на остри бъбречни увреждания [21], както и при лица с диабет тип 2, които имат нормоалбуминурия [28]. Докато нивата на серумния креатинин могат да бъдат повлияни от пола, възрастта, диетата, мускулната маса и телесната маса, нивата на цистатин С са независими от пола, мускулната маса и злокачествеността [21, 27]. Следователно плазменият цистатин С е измерен на подгрупа от проби (

на група) с използване на наличен ELISA комплект (кат. номер MSCTCO; R&D Systems, Минеаполис, MN, САЩ) съгласно протокола на производителя.

H2O2 в урината, биомаркер на възпаление, оксидативен стрес и бъбречна функция, също беше измерен на подгрупа от проби (

на група), използвайки наличен комплект (кат. номер ab102500; Abcam, Кеймбридж, Масачузетс, САЩ). Концентрациите на креатинин се измерват от същите проби от урина (кат. Номер CR01; Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, MI, USA) и се изчислява съотношението H2O2: креатинин в урината. Нивата на H2O2 в урината и тъканите често се изследват при изследвания на бъбречната функция. Установено е, че повишеното бъбречно перфузионно налягане, свързано с хипертония, повишава екскрецията на H2O2 [29]. Тъй като H2O2 може да стимулира протеинурия, понякога се използва като индикатор за започване на бъбречна патология [30].

2.4. Възпалителни маркери
2.5. Оксидативен стрес

Бъбреците са особено податливи на оксидативен стрес поради високата концентрация на дълговерижни полиненаситени мастни киселини, които лесно се подлагат на пероксидация на липиди, когато са изложени на реактивни кислородни видове [34]. Липидната пероксидация образува малондиалдехид като краен продукт, който може да бъде открит чрез анализ на реактивно вещество с тиобарбитурова киселина (TBARS), маркер за окислително увреждане, който често се изследва. Подгрупа от проби (/ група) бяха използвани за оценка на бъбречното липидно пероксидиране, като се използва търговски наличен комплект за анализ на TBARS (кат. Номер 0801192; ZeptoMetrix Corporation, Buffalo, NY, USA).

8-хидрокси-2′-деоксигуанозин (8-OHdG) е чувствителен биомаркер на оксидативен стрес в тъканите и телесните течности и е основен продукт на увреждане, причинено от оксидативен стрес на ДНК. 8-OHdG се получава чрез ензимно разцепване на гуаниновата основа, основата, най-податлива на окисляване. Плазмени проби (чау; HFD) бяха филтрирани с 30 kDa ултрафилтър (кат. Номер UFC503096; EMD Millipore, Billerica, MA, USA) и 8-хидроксигуанозин, 8-OHdG и 8-хидроксигуанин бяха изследвани като биомаркери на окислителната ДНК и Повреда на РНК с помощта на наличен в търговската мрежа комплект (Кат. Номер 589320; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), тъй като е доказано, че оксидативният стрес е повишен по време на ранна бъбречна недостатъчност.

2.6. Статистически анализи

Данните са изразени като средна стойност ± SEM. Статистическите анализи бяха изчислени с помощта на SigmaPlot (Systat Software Inc., версия 13.0; Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Данните бяха тествани за нормалност и след това анализирани с помощта на Student’s

-тестове или Mann-Whitney

тестове, според случая.

стойности ≤ 0,05 се считат за значими.

3. Резултати

3.1. Морфометрия

Въпреки че плъховете с HFD обикновено тежат повече от плъховете, хранени с чау, тази разлика не е статистически значима за животните, изследвани в това проучване (Таблица 1). Плъхове, хранени с HFD, демонстрират значително увеличена маса на епидидималната мастна тъкан в сравнение с животни, хранени с чау, установявайки, че затлъстяването се увеличава от HFD (Таблица 1). Обиколката на талията на животните с HFD е значително увеличена в сравнение с контролите, хранени с чау, което показва, че HFD увеличава коремното затлъстяване (Таблица 1). Дължините на опашките, маркер на общия растеж, не се различават значително (Таблица 1). Бъбречните маси на плъховете с HFD са значително по-големи в сравнение с бъбречните маси на животни от групата на чау (Таблица 1).

Морфологичните анализи с използване на оцветени с хематоксилин и еозин тъканни секции не показват структурни разлики между групите на чау и HFD, което показва, че въпреки че масата на HFD бъбреците е била увеличена, увреждането на микроструктурата на бъбреците не е очевидно (Фигура 1).


3.2. Биомаркери на бъбречната функция

Съотношенията белтък в урината: креатинин на плъховете от чау и HFD не се различават значително, което показва, че филтриращата способност на бъбреците с HFD плъхове не е увредена (Таблица 2). Също така няма разлика в концентрациите на креатинин в урината от двете групи (Таблица 2). Въпреки че концентрациите на HFD в плазмата на цистатин С обикновено са по-високи от плъховете на чау, разликата не е достатъчна, за да заслужи статистическа значимост (Таблица 2). Концентрациите на водороден пероксид в урината са значително увеличени при HFD животни. Съотношенията H2O2: креатинин обаче не се различават значително между групите на чау и HFD (Таблица 2).

-тестове с изключение на съотношението протеин в урината: креатинин, което е анализирано от Mann-Whitney

3.3. Възпалителни маркери

Western blot анализи на бъбречна тъкан не установяват значима разлика в TNFα експресия на протеини на бъбреците на чау и HFD плъхове (Фигура 2). Количественото определяне на Western blots на експресията на IL-6 в бъбречните тъкани също не показва разлика между бъбреците от чау и плъхове с HFD (Фигура 3).


/ група). Ретроперитонеалната мастна тъкан от HFD плъх е използвана като положителна контрола (+) и е показана в първата колона. Данните бяха анализирани от Student’s

-тестове и се изразяват като средни стойности ± SEM.


чау и 6 HFD плъхове). Ретроперитонеалната мастна тъкан от HFD плъх е използвана като положителна контрола (+) и е показана в последната колона. Данните бяха анализирани от Student’s

-тестове и се изразяват като средни стойности ± SEM.

3.4. Маркери за оксидативен стрес

Бъбречната TBARS, мярка за тъканния оксидативен стрес чрез липидна пероксидация, не е била значително повишена при HFD плъхове (Таблица 2). Бяха изследвани плазмените нива на окислена ДНК и РНК, количествено определени като плазмени нива на множество маркери за оксидативен стрес, включително 8-хидроксигуанозин от РНК, 8-OHdG от ДНК и 8-хидроксигуанин. Няма значителни разлики между групите плъхове с чау и HFD (Таблица 2).

4. Дискусия

Младите (1,5-месечни) мъжки плъхове Sprague-Dawley, хранени с HFD (60% мазнини) в продължение на шест седмици, развиват значително увеличение на обиколката на талията и масата на епидидималната мастна тъкан, заедно с тенденция към увеличаване на телесната маса (Таблица 1). Няма значителна разлика в дължината на опашката на животните при диетите с HFD и чау (таблица 1), което показва, че животните са с подобен размер на тялото. Тези данни също показват, че плъховете, използвани за настоящото проучване, развиват повишено затлъстяване. Използването на животински модел, който имитира ефектите на метаболитния синдром и преддиабет, е в съответствие с предходни проучвания на приема на HFD както от мишки, така и от плъхове [5, 8, 33, 35–39]. Предишни изследвания от нашата лаборатория също показват, че 6 седмици HFD води до хипергликемия, нарушен глюкозен толеранс, хипертония, ендотелна дисфункция, оксидативен стрес (плазмени TBARS) и възпаление (плазмен TNFα) при тези животни, което показва, че плъховете с HFD също са модели на метаболитен синдром [13, 14].

Бъбречните маси на HFD плъховете, изследвани в настоящото проучване, са значително по-високи от плъховете с чау (Таблица 1). Липсата на разлика в дължините на опашките (Таблица 1) означава, че увеличената маса не е причинена от общия растеж на животните и вместо това предполага структурно увреждане на бъбреците. Altunkaynak и сътр. [8] установи подобно увеличение на телесната и бъбречната маса на плъхове, хранени с HFD (30% мазнини) в продължение на 12 седмици. Повишената бъбречна маса може да се отдаде на хипергликемия, тъй като пролиферацията и хипертрофията на мезангиалните клетки и удебеляването на гломерулната базална мембрана насърчават повишената бъбречна маса [40] заедно с вазодилатация, възпаление и увеличаване на съединителната тъкан [8]. Въпреки увеличената обща маса на бъбреците, хематоксилиновото и еозиновото оцветяване на HFD бъбреците не показват данни за морфологично увреждане (Фигура 1). Това е за разлика от дългосрочните изследвания на HFD, за които е доказано, че причиняват морфологични бъбречни промени като гломерулна капилярна дилатация, увеличени лумени в тубулите и капсулата на Боуман, натрупване на извънклетъчни протеини, деградация на нефрона, удебеляване на гломерулната мембрана, гломерулосклероза, бъбречна функция и тубуларна интерстициална клетъчна некроза и скъсени тубуларни епители [5, 8, 41].

Плазменият цистатин С се счита за маркер за ранна бъбречна дисфункция и липсата на разлика между концентрациите на цистатин С в HFD и плъхове, хранени с чау, показва, че шестседмичният протокол за хранене може да не е бил достатъчно дълъг, за да започне функционално бъбречно увреждане (Таблица 2). Групата с HFD наистина е развила по-високи концентрации на плазмен цистатин С; тази разлика обаче не е статистически значима (Таблица 2). Въпреки че нивата на цистатин С в плазмата са показани като ранен чувствителен маркер на бъбречна дисфункция, тези резултати показват, че бъбреците на плъхове, хранени с HFD, не са били достатъчно увредени, за да се предотврати филтрирането на цистатин С [22–24, 43 ]. Muntner et al. [44] демонстрира, че серумният цистатин С може да бъде повишен при лица, които не проявяват признаци на микро- или макроалбуминурия или бъбречно заболяване. По-скоро авторите заключават, че серумният цистатин С е корелиран със сърдечно-съдови заболявания при пациенти с наднормено тегло [44]. Следователно, плазменият цистатин С сам по себе си може да не е точна оценка на GFR.

H2O2 е ранен маркер на оксидативен стрес и възпаление. Въпреки повишеното бъбречно перфузионно налягане, което е свързано с хипертония и повишена екскреция на H2O2, няма значителна разлика в съотношението H2O2: креатинин в урината между двете групи (Таблица 2). Повишеният H2O2 в групата с HFD би показал ранно бъбречно увреждане, тъй като е установено, че H2O2 е повишен преди спад на GFR, протеинурия и по-силни възпалителни и фиброзни реакции след хранене с високо съдържание на мазнини [30, 37, 38]. Като цяло, тези резултати показват, че въпреки че предишни проучвания показват, че плъховете с HFD развиват плазмен и съдов оксидативен стрес и възпаление в допълнение към ендотелната дисфункция [13, 14], тези патологии не са достатъчни, за да увредят бъбречната функция.

Предишни проучвания на 6-седмични плъхове с HFD показват, че плазменият TBARS, мярка за оксидативен стрес на цялото тяло, е увеличен в сравнение с контролите, хранени с чау [13]. Въпреки увеличените плазмени TBARS, бъбречните TBARS не се различават значително между плъхове, хранени с HOW и HFD (Таблица 2). Тези резултати показват, че въпреки че плъховете с HFD проявяват системен оксидативен стрес, оксидативният стрес в бъбреците все още не е очевиден. Освен това не се наблюдава значителна разлика между окислителното увреждане на ДНК/РНК между експерименталната и контролната групи (Таблица 2). Оксидативният стрес, изследван чрез TBARS и окисляване на ДНК/РНК, е положително корелиран [50]. Липсата на значителни TNFα и експресията на IL-6 в бъбречната тъкан, изследвана в настоящото изследване, е в съответствие с наблюдаваната липса на оксидативен стрес в бъбреците, тъй като възпалението и оксидативният стрес обикновено са свързани [51].

5. Заключения

В заключение, освен морфологичните промени, единствените основни статистически значими констатации в това проучване са увеличение на висцералното затлъстяване и бъбречната маса след краткосрочна HFD. Това проучване е ново, тъй като е първото, което изследва HFD само за шест седмици; преди това проучване, най-краткият протокол за хранене, който е очевиден в литературата, е четири седмици, в който момент са изследвани само морфологични промени, за разлика от измерванията на бъбречната функция. Предишни изследвания, проведени върху шестседмичния модел на HFD плъхове, показват доказателства за метаболитен синдром, включително значителен съдов оксидативен стрес и възпаление, ендотелна дисфункция, хипертония, хипергликемия, хиперлептинемия и нарушен глюкозен толеранс [13, 14].

Възможно е методите, използвани в това проучване, да не са били достатъчно чувствителни, за да открият фини промени в бъбречната функция. В предишни проучвания от нашата лаборатория, 6 седмици HFD значително повишават плазмените концентрации на кетон бета-хидроксибутират от

при чоу плъхове до mg/dL при HFD животни [14]. Като се има предвид, че кетогенните диети могат да намалят бъбречните реакции към глюкозата, възможно е също така HFD да упражнява защитен ефект върху бъбреците [51]. Това беше показано в предишно проучване на миши модели на диабет тип 2 с нефропатия, при което 8 седмици консумация на кетогенна диета напълно нормализираха съотношенията албумин: креатинин и експресията на гени, свързани със стреса [51]. Следователно от настоящото проучване е видно, че продължителната хипергликемия и възпаление вероятно са необходими за предизвикване на значителни промени в бъбреците или че HFD може да упражнява някои защитни ефекти чрез повишено генериране на кетони.

Конфликт на интереси

Авторите декларират, че няма конфликт на интереси по отношение на публикуването на тази статия.

Благодарности

Това проучване е финансирано от награда за програма за подпомагане на научни изследвания от ASU (Catherine Crinigan), както и от Sigma Xi Grant-in-Aid of Research (Catherine Crinigan). Авторите биха искали също да благодарят на Кристин Риклефс (ASU), Марк Жирар (Университет в Поатие, Франция) и Зоха Ахмед (ASU) за техническа помощ при проучването.

Препратки