Настоящ адрес: Имперски колеж в Лондон, катедра по имунология, Лондон, Великобритания

хранене

Присъединяване Ливърпул училище по тропическа медицина, Ливърпул, Великобритания

* До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: [email protected]

Присъединяване Ливърпул училище по тропическа медицина, Ливърпул, Великобритания

Фигури

Резюме

В природата разпространението на инфекцията с Leishmania в цели популации от пясъчни мухи може да бъде много ниско (Leishmania mexicana се отслабва от средната част на вектора на пясъчната муха, придружена от вискозен гелоподобен материал от паразитен произход [7]. Този промастиготен секреторен гел (PSG ) е мощен фактор за вирулентност на паразитите и заедно със слюнката от пясъчна муха значително усилва кожните инфекции при съвместно доставяне в кожата на бозайника гостоприемник [7,8]. Основният компонент на гела, отговорен за обостряне на заболяването, е нишковидният протеофосфогликан (fPPG), гликопротеин с много висока молекулна маса, уникален за Leishmania [9].

Тези различни преди описани ефекти на паразита върху гостоприемника на пясъчната муха насърчават контакта и предаването на гостоприемник и по този начин са потенциално изгодни за паразита, но са полезни странични продукти от инфекцията, а не са примери за истинска манипулация. Освен това е важно да се има предвид, че контактът с гостоприемника и храненето с кръв не идват без рискове и представляват значителна опасност както за преносителите, така и за паразитите, когато гостоприемникът се защитава [19], така че не е ясно дали някой от тези ефекти са избирателно изгодни. При такъв сценарий времето за предаване е критично, за да се сведе до минимум рискът от смърт и да се насърчи оцеляването на вектора достатъчно дълго, за да завърши развитието на паразита до инфекциозност [1,2,19,20]. В това проучване ние изследваме поведението на заразените с Leishmania пясъчни мухи. Ние описваме елегантен и нов пример за поведенческа манипулация, при който времето за развитие на паразита е свързано с устойчивостта на хранене на вектора на пясъчната муха и демонстрираме, че подобна стратегия засилва предаването на Leishmania.

Резултати/дискусия

Leishmania придобиват тяхната инфекциозност по време на формирането на гелната запушалка

(А) Мухите са заразени чрез мембранно хранене с амастиготи от L. mexicana (запълнени квадрати) или L. infantum (запълнени кръгове), десет мухи/група, събрани дневно, и е определен средният брой метацикли/муха. Лентите за грешки представляват 1 s.m.

(Б) Натрупване на fPPG в средните черва на заразени пясъчни мухи. Хомогенати на средното черво от мухи, заразени с L. mexicana (горен панел) или L. infantum, анализирани чрез SDS-PAGE и имуноблотинг, използвайки AP3 mAb за откриване на наличието на fPPG гликани. Пътека С е неинфектирана контролна проба, хранена с кръв от ден 7.

(C) Метациклогенеза в пясъчни мухи, заразени с експоненциална фаза на L. mexicana - (затворени квадрати) или стационарна фаза - (полуквадрати) култивирани амастиготи. Лентите за грешки представляват 1 s.m. Звездичките показват статистически значими разлики (p L. mexicana експоненциална фаза (горен панел) или стационарна фаза (долен панел) амастиготи, анализирани чрез SDS-PAGE и имуноблотинг с използване на AP3.

Лейшманията намалява продължителността на живота на техните вектори

(А) Нормални условия за насекоми. Мухите са били хранени чрез мембранно хранене само с заешка кръв (запълнени квадрати), кръв, съдържаща амастиготи на лезия L. mexicana (отворен триъгълник) или амастиготи на далака L. infantum (отворен кръг). Групи от 300 хранени женски мухи са наблюдавани ежедневно за появата на нови смъртни случаи.

(Б) Стресови условия. Експериментът е извършен както в (А), с изключение на това, че мухите са стресирани ежедневно, като ги инкубират при 16 ° C без захарно брашно в продължение на 2 часа и ги принуждават да летят по време на 30-минутен период чрез непрекъснато разбъркване на клетката.

(C) Ефект на скоростта на развитие на L. mexicana върху оцеляването на вектора на пясъчната муха. Мухите бяха заразени с L. mexicana експоненциална фаза - (отворен отворен триъгълник) или стационарна фаза - (отворен отворен триъгълник) култивирани амастиготи и поддържани при нормални инсекторни условия.

(D) Експериментът е извършен както в (C), с изключение на това, че мухите са били стресирани ежедневно, както е описано за (A).

Leishmania не променя плодовитостта на пясъчната муха

След това изследвахме възможните ефекти на Leishmania върху плодовитостта, тъй като инфекцията на определени вектори (например малария при комари) може да намали репродуктивната годност, като предизвика производството на по-малко яйца [2]. При комарите се предполага, че това може да бъде компенсаторен механизъм за подобряване на намаленото дълголетие чрез пренасочване на ресурси, които иначе биха били използвани за производство на яйца и полагане на яйца, което позволява на паразита да завърши развитието си до инфекциозни спорозоитни форми. Въпреки това, когато разгледахме тази възможност, нито една от описаните тук инфекции на Leishmania (L. mexicana/L. Infantum, стресирана или ненатоварена) не оказа значително влияние върху непосредствената репродуктивна годност, измерена чрез производството на яйца (Таблица S1), което показва, че това е не стратегия, използвана от Leishmania в този вектор.

Хипотеза: Пясъчните мухи, заразени с лейшмания, са по-устойчиви при хранене с кръв

Leishmania манипулира пясъчните мухи, за да продължат да се хранят с кръв

(А) Връзка между броя на метацикличните промастиготи в Lu. longipalpis и упоритост при хранене. Мухите са заразени с амастиготи от L. mexicana (затворен кръг) или L. infantum (отворен триъгълник). От 4 d мухи след заразяване се анализират за тяхната устойчивост на хранене в 10-минутен поведенчески анализ и след това се дисектират, за да се определи общият брой на наличните метациклични промастиготи. Устойчивостта на хранене на всяка отделна муха се начертава спрямо броя на метацикличните промастиготи, които те са приютили. Коефициент на линейна корелация, r 2 = 0,504 за L. mexicana (L. m) и 0,705 за L. infantum (L. i).

(Б) Постоянност при хранене на заразени от L. infantum мухи, хранени със заешка кръв самостоятелно (отворен квадрат) или заразени с L. infantum амастиготи (затворен квадрат). Устойчивостта на мухите, изложени индивидуално на обезболена мишка, се наблюдава ежедневно. n = 16 пясъчни мухи на точка, представляващи комбинацията от два независими експеримента. Ленти за грешки 1 s.m.

(C) Устойчивост на хранене на заразени от L. mexicana мухи, експериментален дизайн, както в (B). Мухите са хранени със заешка кръв самостоятелно (отворен квадрат) или заразени с L. mexicana (затворен кръг).

Заразените с лайшмания пясъчни мухи се хранят с множество домакини

(А) Инфекциозност на метациклични промастиготи на L. mexicana, получени от мухи. Мухите бяха заразени с експоненциална фаза или стационарна фаза на култивирани аметиготи от L. mexicana, инфекции, оставени да узреят (ден 7), след това бяха получени метациклични промастиготи, измити и инжектирани 10 3 паразита в десния крак на всяка мишка BALB/c. Показани са данни от две групи от шест мишки, заразени с метациклични промастиготи от експоненциална фаза - (затворен квадрат) или стационарна фаза - (полуквадрат) инфекции, получени.

(B и C) Влияние на постоянството при хранене върху инфекцията с Leishmania при мишки. Мухите са били заразени с експоненциална (затворен квадрат или отворен квадрат) или неподвижна фаза (затворен кръг или отворен кръг) L. mexicana-култивирани амастиготи. Ден 7 - заразените мухи бяха изложени индивидуално на дясната лапа на обезболели мишки BALB/c и им беше позволено да се хранят за 15 минути с ([B], затворен кръг или затворен квадрат) или без ([C], отворен квадрат или отворен кръг) прекъсване.

Заключения

По-рано се предполагаше, че прикрепването на паразити Leishmania в контакт с предното черво може да повлияе на функцията на механорецепторите, които откриват притока на кръв, и това може да обясни намалената способност на мухите да приемат кръвно хранене [4,30]. Въпреки това, с оглед на представените тук резултати, ние предлагаме, че функционирането на тези механорецептори е нарушено от fPPG, който играе ролята на молекула-манипулатор. Това от своя страна може да насърчи състоянието на глад и упоритостта на мухата или алтернативно да увеличи праговия обем на кръвта, при който поведението за търсене на кръв е инхибирано. Понастоящем прилагаме геномичен подход за изследване на ефекта от инфекцията върху пясъчните мухи [31], което може да ни позволи да идентифицираме гени, участващи в манипулацията. Освен това в крайна сметка се стремим да разгледаме ролята на манипулацията в полеви условия.

Материали и методи

Култура и морфология на лайшмания.

L. mexicana (MNYC/BZ/62/M379) или L. infantum (син. Leishmania chagasi) (MHOM/BR/76/M4192) са култивирани, както е описано по-горе [22,32]. Формалин-фиксирани проби от паразити бяха преброени с помощта на хемоциктометър на Нойбауер и тяхната морфология на развитието беше оценена чрез измерване на паразити от оцветени с Giemsa цитонамазки, използвайки системата на Rogers et al. [17].

Инфекция с пясъчна муха и оцеляване.

Петдневните женски мухи Lutzomyia longipalpis (Jacobina щам) са заразени с L. mexicana или L. infantum amastigotes чрез изкуствена мембранна система за хранене с плътност 2 × 10 6 amastigotes/ml в прясна заешка кръв [33]. Амастиготите на L. mexicana са събрани от лезии на задната част на женските мишки BALB/c, а амастиготите на L. infantum са изолирани от далаците на мишките BALB/c. В някои експерименти, L. mexicana amastigotes са били култивирани с аксен преди употреба [34]. Хранените с кръв мухи бяха разделени и поддържани при 12-часов светлинен цикъл: тъмен цикъл при 28–30 ° C, 80% –95% относителна влажност и снабдени със 70% (w/v) захароза ad libitum. На мухите е отказана възможността да снасят яйца, за да се сведе до минимум смъртността след отлагане на яйцеклетките [16] и се наблюдава, че всички разрязани мухи със зрели инфекции съдържат яйца (гравидни). В някои експерименти женските мухи се стресират ежедневно, като ги инкубират при 16 ° C без захарно брашно в продължение на 2 часа и като ги принуждават да летят по време на 30-минутен период, като разбъркват клетката. За да се оцени оцеляването на пясъчната муха, клетките са били наблюдавани ежедневно за появата на нови смъртни случаи. Статистическият анализ на данните за оцеляване е извършен с помощта на log rank тест [35].

Натрупване на PSG.

Събраните заразени хомогенати от пясъчна муха бяха имуноблотирани за откриване на fPPG, използвайки моноклонално антитяло AP3, както е описано по-рано [7].

Изпитване за устойчивост на ухапване.

Анализ на втория избор на домакин.

Използвана е модифицирана форма на теста за устойчивост, при която мухите са тествани индивидуално за решението им да се хранят с алтернативен гостоприемник при прекъсване. Две анестезирани мишки BALB/c бяха държани на разстояние 10 cm в 25-сантиметрова клетка и изложени на единични мухи. Когато една муха започна да се храни с мишка, беше позволено още една минута, преди да бъде прекъсната. След това мухата се прекъсваше на всеки 10 s, ако се опита да продължи да се храни със същата мишка. Прекъсването на храненето се извършва, докато или мухата започне подаване на противоположната мишка, или докато изтекат 15 минути. Мухите са били възпрепятствани да се хранят чрез внимателно четкане на антените между опитите за хранене. Мухите се дисектират след анализа, за да се потвърди инфекцията, където е подходящо.

Инфекция на мишки.

Женски мишки BALB/c са заразени или чрез инжектиране на 10 3 метациклични промастиготи чрез игла в дорзалната повърхност на десния заден крак, или чрез позволяване на единични заразени пясъчни мухи да хапят на същото място [7]. Развитието на лезиите се наблюдава чрез измерване на подуването на десния крак с апарати Vernier и изваждане на ширината на контралатералния незаразено стъпало. В края на експериментите мишките бяха евтаназирани хуманно и тежестите от паразити в краката се определяха или чрез директно преброяване чрез хемоцитометър, или чрез ограничаване на разреждането. Всички процедури, включващи животни, са одобрени от местния комитет за хуманно отношение към животните и са извършени в съответствие с правителството на Обединеното кралство (Министерството на вътрешните работи) и разпоредбите на ЕО. Последователните измервания за всяка отделна мишка бяха използвани за изчисляване на площта под кривата за график на дебелината на лезията във времето [36]. Разпределението на стойностите не показва доказателства за ненормалност, използвайки теста на Шапиро-Уилк и следователно е извършен параметричен анализ (t тестове). Нулевата хипотеза беше отхвърлена, ако p L. mexicana инфекция върху обема на кръвната храна, получена от пясъчни мухи

Всички мухи са заразени с 2 × 106 амастиготи на лезия на ml заешка кръв чрез мембранно хранене. Мухите с 4- до 10-дневни инфекции са били изложени индивидуално на една обезболена мишка и относителният размер на полученото им кръвно брашно (нито едно, частично или пълно) след един опит за хранене е регистриран при дисекция, заедно с общия брой на паразити във всяка муха. Данните се събират от множество експерименти.

Таблица S4. Ефект на инфекция с L. infantum върху обема на кръвната храна, получен от пясъчни мухи

Всички мухи са заразени с 2 × 106 амастиготи на далак на ml заешка кръв чрез мембранно хранене. Мухите с 4- до 10-дневни инфекции са били изложени индивидуално на една обезболена мишка и относителният размер на полученото им кръвно брашно (нито едно, частично или пълно) след един опит за хранене е регистриран при дисекция, заедно с общия брой на паразити във всяка муха. Данните се събират от множество експерименти.

Благодарности

Благодарим за техническата помощ на Davina Moor и Jonathan Archer.

Принос на автора

MER и PAB замислят и проектират експериментите, анализират данните и написват статията. MER извърши експериментите.

Препратки

Тематични области

За повече информация относно предметните области на PLOS кликнете тук.

Искаме вашите отзиви. Имат ли смисъл тези предметни области за тази статия? Щракнете върху целта до неправилната тема и ни уведомете. Благодаря за вашата помощ!

Е тематичната област "Паразитни болести" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Пясъчни мухи" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Лейшмания" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Амастиготи" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Кръв" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Промастиготи" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Вектори, пренасяни от болести" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Leishmania infantum" приложим за тази статия? да не