• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: mikhail.vyssokikh @ gmail.competya @ genebee.msu.ru

Редактирано от Игор Улицки, Научен институт Вайцман, и прието от члена на редакционния съвет Дейвид Дж. Мангелсдорф 28 януари 2019 г. (получено за преглед на 7 юни 2018 г.)

кодове

Значимост

Късите пептиди са кодирани в геноми на всички организми и имат важни функции. Поради малкия размер на такива отворени рамки за четене, те често се пренебрегват от автоматичното анотиране на генома. Изследвахме гена, който бе анотиран като дълго некодираща РНК LINC00116 и демонстрирахме, че този ген кодира 56-аминокиселинен пептид Mtln, който е локализиран в митохондриите. Инактивирането на кодиращия ген на Mtln води до намаляване на консумацията на кислород, свързано с активността на дихателния комплекс I и нарушава липидния състав на клетката. Това влияние се медиира от взаимодействие на Mtln с NADH-зависим цитохром b5 редуктаза. Нарушаване на митохондриалната локализация на последните фенокопира Mtln инактивиране.

Резюме

Гените, кодиращи малки пептиди, често са погрешно анотирани като дълго некодиращи РНК (lncRNA) гени. Тук демонстрирахме, че една такава транскрипция се превежда в 56-аминокиселинен пептид, запазен в хорди, потвърждаващ работата, публикувана по време на прегледа на този ръкопис. Mtln пептидът може да бъде открит в митохондриите на миши клетъчни линии и тъкани. В съответствие с неговата митохондриална локализация, липсата на Mtln намалява активността на митохондриалния дихателен верижен комплекс I. За разлика от интегралните компоненти и сглобяеми фактори на NADH: убихинон оксидоредуктаза, Mtln не променя пряко своята ензимна активност. Взаимодействието на Mtln с NADH-зависим цитохром b5 редуктаза стимулира комплекс I, функциониращ най-вероятно чрез осигуряване на благоприятен липиден състав на мембраната. Изследването на Mtln осветява значението на малките пептиди, чиито гени често могат да бъдат неправилно анотирани като lncRNAs, за контрола на жизненоважни клетъчни процеси.

Много малки пептиди са локализирани в митохондриите, органела, чиито основни функции са дишането, свързано с производството на АТФ, хомеостазата на Ca 2+, поддържането на клетъчно окислително-редукционен потенциал, синтез на стероиди, хем, FeS клъстери, индукция на апоптоза и много други, накрая контролиращи съдбата на клетките и функционалната цялост на тъканите (15). Митохондриалният протеом на бозайниците се състои от над 1100 протеина (16), като 5% от този брой са малки протеини с дължина под 100 аминокиселини (17). Както митохондриалните (18, 19), така и ядрените геноми кодират късите митохондриални пептиди, които са неразделни компоненти на комплексите за окислително фосфорилиране (OXPHOS) (17) или техните фактори за сглобяване (20) и играят значителна роля в дълголетието (21), инсулиновата резистентност (19) и модулация на апоптозата (18). Мутациите в гени, кодиращи малки пептиди, пребиваващи в митохондриите, могат да имат патологични резултати, като митохондриални енцефаломиопатии (22) и болест на Leigh (23).

Тук ние описваме миши пептид, кодиран в ген, анотиран като 1500011k16Rik lncRNA, съответстващ на човешки LINC00116. Пептидът се намира в митохондриите и е важен за активността на дихателния верижен комплекс I. След първия ни доклад за функцията на този пептид на конференцията (24) и докато този ръкопис беше в процес на преглед, две групи публикуваха подобни заключения за функционалната роля на този пептид (25, 26), наречен Mitoregulin, Mtln.

Резултати

Анализ на 1500011k16Rik потенциал за кодиране.

Много lncRNAs съдържат предполагаеми ORF, възникнали случайно и не преведени във функционален пептиден обект. Мишият 1500011k16Rik транскрипт съдържа 56-аминокиселинен ORF с предсказан еднопроходен трансмембранен сегмент (27), но не и който и да е детектируем домен. Няколко характеристики на последователността са показателни за кодиращия потенциал. Анализът на запазването на нуклеотидите на гените, хомоложни на 1500011k16Rik (фиг. 1А), сред 60 вида гръбначни животни (28), разкрива, че регионът на предполагаемия ORF е най-и почти единственият запазен регион на гена. Анализът на обобщените данни за профилиране на рибозоми (29) разкрива значително покритие на рибозомата на предполагаемия ORF (приложение SI, фиг. S1A). Подравняването на предполагаемите продукти на транслацията на ORF разкрива висока степен на запазване на нивото на аминокиселината (фиг. 1В) с високо съотношение на синоними спрямо несинонимни кодонови замествания и липса на преждевременни стоп-кодони в рамката (SI приложение, фиг. S1 В и В). В резултат на това стигнахме до заключението, че транскриптът 1500011k16Rik е най-вероятно да бъде транслиран в 56-аминокиселинен пептид, който ще наричаме Mitoregulin (Mtln) (25) за последователност в научната литература.

Анализ на запазването на Mtln. (А) Област на генома на мишка, обхващаща гена 1500011k16Rik. Показани са екзони и ORF местоположение. Диаграма за опазване на гръбначните животни (28) е показана под картата. (Б) Подравняване на Mtln пептидни последователности в гръбначните животни.

Кодираният пептид 1500011k16Rik се експресира и локализира в митохондриите.

1500011k16Rik кодира нов полипептид. (А) Конфокални изображения на mCherry-маркиран Mtln пептид; митохондриите бяха оцветени от MitoTracker Green FM и ядрата от Hoechst 33342. (Скала, 10 μm.) (B) Имуноблотинг на изолирани митохондрии от NIH 3T3 и клетъчни лизати от NS0 клетки за ендогенни Mtln. Tom20 и β-актин бяха използвани като контрол на натоварването. ∆Mtln -1, -2, -3 са различни нокаути за клетъчната линия NIH 3T3. (C) Имуноблотинг на лизати на миши органи за ендогенни Mtln. PARK7 е използван като контрол на натоварването (67).

Респираторен комплекс I Електронната трансферна активност е нарушена в нокаутните клетъчни линии.

За да тестваме влиянието на Mtln върху дишането на митохондриите, сравнихме клетките NIH 3T3 и NS0 с техните производни с инактивиран ген 1500011k16Rik, кодиращ Mtln (приложение SI, фиг. S2A). Разпределението на клетките с висок и нисък митохондриален мембранен потенциал е тествано чрез съотношението на флуоресцентното багрило JC-1 и FACS анализ. Нивото на общото производство на реактивни кислородни видове (ROS) в клетки от див тип и мутантни клетки е оценено чрез FACS анализ с помощта на 2 ', 7' - дихлорофлуоресцин диацетат (DCFDA). За разлика от резултатите на Stein et al. (25) не виждаме значителна разлика между клетки от див тип и нокаут в производството на ROS заедно с мембранния потенциал (приложение SI, фиг. S4 A и B).

Mtln взаимодейства с Cyb5r3. (А) Имунопреципитация на HA-Mtln от NIH 3T3 клетки, последвана от имуноблотинг с анти-Mtln антитела (отгоре) и анти-Cyb5r3 антитела (отдолу). Клетки, експресиращи Mtln без етикет бяха използвани като контрола. (B) Активност на комплекси I – IV в Cyb5r3 (Gly2 до Ala2) мутантни клетки (∆Cyb5r3mito). Стойностите са средно за четири независими експеримента, направени в три екземпляра. За статистически значимата промяна, коригирана по множественост стойност P (P + Balance.

Намаленият принос на NADH: убихинон оксидоредуктазата в митохондриалното дишане може да се обясни с по-ниска скорост на регенерация на NADH. За да оценим влиянието на нокаута на Mtln върху баланса на NADH/NAD +, ние приложихме флуоресцентен протеинов сензор SoNar (31). Установихме, че в стационарно състояние нокаут клетките от див тип и Mtln не демонстрират значителна разлика в цитоплазмения баланс NADH/NAD + редокс (SI Приложение, Фиг. S9A). В допълнение, решихме да оценим динамиката на промените на редокс баланса в цитозола, засегнат от различни метаболитни субстрати (SI Приложение, Фиг. S9 B и C). Тестът разкри липса на разлика в динамиката на NADH/NAD + между родителските и изчерпаните Mtln клетки. Можем да заключим, че цитозолният редокс баланс не се влияе от аблация на Mtln.

Как Mtln влияе на Cyb5r3?

Често образуването на протеинов комплекс е необходимо за стабилизиране на компонентите срещу протеолиза. Това обаче не е така за взаимодействието на Cyb5r3 с Mtln, както се разкрива чрез имуноблотиране на Cyb5r3 в нокаутиращи клетки на Mtln (приложение SI, фиг. S10A). За да оценим всяко възможно влияние на Mtln върху локализацията на Cyb5r3, използвахме клетъчни линии, екктопично експресиращи сливания протеин Cyb5r3-eGFP. Локализацията на слят протеин Cyb5r3 изглежда е митохондриална както в родителската NIH 3T3 клетъчна линия, така и в нейното производно, лишено от Mtln пептида (SI Приложение, Фиг. S10B). Освен това не наблюдаваме никаква разлика в нивото или локализацията на Mtln при muCyb5r3mito мутация (SI приложение, фиг. S10 C и D).

Cyb5r3 катализира окислително-възстановителните реакции с няколко различни субстрата, докато използва само NADH като донор на електрон, който е един от основните консуматори на цитозолния NADH (32). За да тестваме влиянието на Mtln върху способността на Cyb5r3 да окислява NADH, ние измерихме неговата NADH дехидрогеназна активност в реакция с K3 [Fe (CN) 6] като фалшив електронен акцептор (SI Приложение, Фиг. S10E). Установено е, че способността на Cyb5r3 да извлича електрон от NADH е независима от присъствието на Mtln.

Два основни процеса, които изискват свързаната с мембраната форма на Cyb5r3, са Δ 9 десатурация на мастни киселини (33) и биосинтез на холестерол (34). За оценка на влиянието на Mtln върху активността на Cyb5r3 в липидния метаболизъм, направихме LC-MS анализ на клетъчни линии NIH 3T3 и NS0 с дефицит в Mtln. Количествено определихме повече от 1000 липиди във всяка клетъчна линия (Материали и методи). Количествата на стотици липиди се променят значително и възпроизводимо (SI Приложение, Фиг. S11A) при изчерпване на Mtln в две независимо произведени NIH 3T3 получени нокаут клетъчни линии. Повечето глицеролипиди са свръхпредставени, докато повечето глицерофосфолипиди са недостатъчно представени при нокаут на Mtln както в клетъчните линии на NIH 3T3, така и в NS0 (фиг. 5А).

Промени в концентрацията на липиди, причинени от нарушаване на локализацията на митохондриите на Cyb5r3 (∆Cyb5r3mito). Връзка между log2 пъти промени, индуцирани от нокаут на Mtln (ос x) и ∆Cyb5r3mito мутант (ос y) в сравнение с дивия тип. Всяка точка представлява един липид, глицеролипиди (GL), глицерофосфолипиди (GP), а други класове липиди са показани съответно в червено, синьо и черно. Най-малката квадратна регресионна линия е показана в червено. Коефициентът на корелация на Пиърсън, неговият 95% доверителен интервал и P стойност (t тест) са показани в горния ляв ъгъл.

Дискусия

Асортимент от къси пептиди, кодирани в геноми на висши организми, като мишка и човек, може да състави почти пренебрегван слой от регулаторни молекули (11, 35, 36). В тази работа ние добавихме списъка на малки функционални пептидни единици от забележителен член, митохондриалният пептид Mtln, в съответствие с резултатите от други групи (25, 26), публикувани по време на тази работа. Mtln е силно консервиран при гръбначните животни и, както се вижда от нашите резултати, функционира в клетъчния метаболизъм.

По-голямата част от малките пептиди проявяват своите функции чрез свързване с партньорски протеин или като съставна част на мултипротеинови комплекси (10), както е показано за сарколипин и фосфоламбан (37, 38), хуманин (18), Toddler/ELABELA (39, 40 ) и DWORF (41). Само няколко малки пептиди имат отделни ензимни функции, като 4-оксалокротонат тавтомераза, чийто мономер съдържа само 62 аминокиселини (42). В съответствие с тази тенденция, ние демонстрирахме, че Mtln пептидът взаимодейства с NADH: цитохром b5 оксидоредуктаза 3 (Cyb5r3). Нарушаването на митохондриалната локализация на последния води до същия фенотип като изчерпването на Mtln по отношение на дихателния комплекс, който приписвам на консумацията на кислород и промяната на липидния състав. По този начин Mtln може да функционира чрез стимулиране на активността на Cyb5r3 в митохондриите, необходимо за поддържане на липидната хомеостаза. Неотдавнашно проучване показа, че Mtln може да взаимодейства и с други митохондриални протеини (26), като HADHA и HADHB, участващи в β-окисляването на мастните киселини. Въпреки че конкретни партньори за взаимодействие на Mtln са идентифицирани в нашето проучване и в работата на Makarewich et al. (26) са различни, и двете се приписват на свързани процеси, които могат да показват участие на Mtln в метаболизма на мастните киселини с особености на тъканния или клетъчния тип.

Тази активност, както демонстрирахме, е необходима за функционирането на дихателен комплекс I в контекста на митохондриалната OXPHOS система, но не и за NADH оксидазната активност на изолиран комплекс I или комплекси I + III. Това наблюдение е в съответствие с това на Stein et al. (25), демонстриращ влияние на дефицита на Mtln върху формирането на суперкомплекси на дихателната верига, съдържащи CI, но не върху сглобяването на CI и асоцииране на CI и CIII комплекси.

На Cyb5r3 бяха приписани множество функции. Освен специфичната за еритроцитите активност на метхемоглобин редуктазата на разтворимата изоформа Cyb5r3 (43), която е малко вероятно да бъде от значение за нашето изследване, закрепеният с мембрани Cyb5r3 е замесен в десатурацията на мастни киселини (33), биосинтеза на холестерола (34), и амидоксимната система, участваща в липогенезата (44 ⇓ –46) и метаболизма на лекарствата.

Материали и методи

Конструкти за инактивация на гени и редактиране на геноми са създадени на базата на плазмида pX458 (59). Конструкциите на Knockin са създадени на базата на транспозонни вектори на Спящата красавица (60, 61). Мониторингът на продукцията на ROS в прилепнали и суспензионни клетки се извършва съгласно протокола, предложен от Wojtala et al. (62). Степента на консумация на кислород се измерва, както е описано (63). Митохондриите от култивирани клетки се изолират чрез диференциално центрофугиране. Ензимната активност на Cyb5r3 се определя в изолирани митохондрии чрез проследяване на NADH-зависимата редукция на ферицианид (64). Екстракцията на метаболит за липиден анализ се извършва, както е описано (65). Нецелевото профилиране на липидомите се извършва в режим на положителна йонизация (66). Работата с животните е одобрена от Комитета по етика на Московския държавен университет при Ломоносов.

Повече подробности за методологията на изследването са предоставени в приложението SI.

Благодарности

Благодарим на Алекс Лебедев за помощта при редактирането на ръкописа; Ксения Смирнова за помощта в отглеждането на клетки; Николай Аниканов и Елена Стеколщикова за извличане на липиди и измервания на мас-спектрометрия за двойни нокаутни клетъчни линии; и д-р Yi Yang за предоставяне на pcDNA3.1-SoNar и pcDNA3.1-iNapC вектори. A.C. благодари на Boehringer Ingelheim Fond за безвъзмездна финансова помощ за посещение на курс по Европейска лаборатория по молекулярна биология. Също така благодарим на Института за наука и технологии „Сколково“ за финансирането на таксите за публикация и таксата за отворен достъп. Тази работа беше подкрепена от грантове на Руската фондация за фундаментални изследвания (RFBR) 17-04-01904 и 18-29-07005 (за P.S. и A.C.); Грант на Руската научна фондация (RSF) 17-75-30027 (на P.S.) за работа, свързана с редактиране на генома; и Научното училище на Московския държавен университет (O.D.). Експерименти върху мишки бяха подкрепени от грант на Министерството на науката на Русия 14.W03.31.0012. П.В. беше подкрепена от стипендията на президента (SP-4132.2018.4). Работата по Mtln Deletion не променя цитозолния баланс NADH/NAD + е подкрепена от RSF Grant 17-15-01175 (за D.B.) и RFBR Grant 18-54-74003 (за V.B.).

Бележки под линия

  • ↵ 1 До кого може да бъде адресирана кореспонденция. Имейл: mikhail.vyssokikhgmail.com или petyagenebee.msu.ru .