Резюме

Мускулната атрофия е основно усложнение на ХБН, свързано с излишната заболеваемост и смъртност. 1,2 Много изследователи са изследвали загубата на мускули, за да се опитат да намерят оптималната терапия за лечение на мускулна атрофия чрез подобряване на мускулния анаболизъм. Все още обаче сме далеч от победата в битката срещу загуба на мускули, предизвикана от ХБН или други метаболитни заболявания.

Стратегиите за предотвратяване или лечение на загуба на мускулна маса при ХБН включват използване на бикарбонатен режим за коригиране на метаболитна ацидоза, 3 използване на анаболни андрогенни стероиди (производни на тестостерон), 4 използване на инхибитори на активирания от пероксизома пролифератор (т.е. розиглитазон) за повишаване на инсулиновата чувствителност и намаляване на инсулина резистентност, 5 и осигуряване на миостатинов инхибитор (пептитяло) 6 или фосфорилирани stat3 инхибитори 7, наред с други. Въпреки това, няма прости и ефективни лечения за индуцирана от ХБН мускулна загуба. Доказано е, че физическите упражнения могат да предотвратят загуба на мускулна маса при ХБН мишки 8 и пациенти с ХБН 9, но пациентите с тежка ХБН често не са в състояние да издържат на рутинно ежедневно физическо натоварване, да не говорим за упражнения.

Акупунктурата като терапевтична интервенция се използва широко в САЩ и по света. 10 Традиционната китайска медицина смята акупунктурата за безопасна, нефармакологична интервенция. 11,12 Проучвания показват, че лечението с акупунктура може да подобри симптомите като умора, стрес, хипертония, протеинурия и сърбеж при пациенти с ESRD на диализа. Доказано е, че акупунктурата намалява атрофията на скелетните мускули, предизвикана от суспензия на задните крайници при мишки. 16 Доказано е, че електрическото акупунктурно лечение потиска експресията на миостатин, което води до свързана със сателитни клетки пролиферативна реакция и възстановяване в скелетните мускули. 17 Нискочестотната електрическа стимулация (LFES) е акупунктурна техника, която възпроизвежда ползите от упражненията за съпротива чрез стимулиране на мускулната контракция.

В скелетните мускули инсулинът или IGF-1 играят решаваща роля в поддържането на протеиновия метаболизъм. По принцип повишеното регулиране на инсулина и сигнализирането на IGF-1 ще предотврати мускулната атрофия, предизвикана от ХБН. 5,8,18–20 IGF-1 се произвежда предимно от черния дроб. Последните проучвания силно включват макрофагите като основния екстрахепатален източник на IGF-1, който допринася за контрола на постнаталния растеж и узряването на органите. 21.

Макрофагите, експресиращи или убиващ, или възстановителен фенотип, сега се наричат ​​главно съответно М1 или М2 макрофаги. 22 М1 и М2 макрофаги имат различни профили на хемокин и хемокин рецептор. M1 макрофагите-убийци се активират от възпалителни цитокини, като IFN-γ. М1 маркерите включват IL-1β и индуцируема азотна оксидна синтаза. За разлика от това, M2 възстановяващите макрофаги функционират в конструктивни процеси, като заздравяване на рани и възстановяване на тъкани, като произвеждат противовъзпалителни медиатори, като аргиназа-1 и IL-10, които се използват като маркери за M2 макрофаги. 23 Макрофагите обикновено липсват или са с много ниско изобилие в мускулите и обикновено са с фенотип М2.

За да проектираме рационални терапевтични подходи за индуцирана от ХБН мускулна атрофия, в това проучване изследвахме дали LFES влияе върху сигналния път на IGF-1. Ние предположихме, че LFES ще регулира синтеза на мускулен протеин и ще регулира разграждането на протеините в мускулите на мишки с ХБН. В допълнение, тук докладваме разширение на оригиналната работа, която изследва дали LFES действа чрез влияния върху възпалението и натрупването на макрофаги, което от своя страна увеличава регулирането на IGF-1 сигнализирането. И накрая, оценихме ефекта на LFES върху специфичните за мускулите микроРНК (myomiRs) като потенциална терапевтична опция.

Резултати

LFES предотвратява индуцирана от CKD мускулна атрофия и подобрява функцията на мускулно сцепление

Мишки (C57BL/6J; мъжки; 8-седмична възраст) бяха разпределени на случаен принцип в четири групи: фалшиви, фалшиви/LFES, CKD и CKD/LFES (n = 12/група). При мишки с CKD стойностите на BUN са били 3,4 пъти по-високи от контролираните мишки, управлявани с двойки, хранени с двойка (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Мускулни и телесни тежести

Функцията за сила на мускулния захват беше увеличена от LFES

LFES подобрява метаболизма на мускулните протеини

p-Akt в групата с ХБН е намалял с 29% в сравнение с фалшивия. Това по-ниско ниво обаче беше обърнато от LFES (Фигура 1А). LFES предотвратява индуцираното от CKD увеличение на FoxO-1 (активна форма) и намаляването на p-FoxO (p-FoxO-Thr32; неактивна форма). Foxo3a е непроменен при CKD мишки (Фигура 1А). За да се провери дали LFES предотвратява катаболизма на мускулния протеин, беше измерено разцепването на актин. ХБН увеличи 14-kD актинови фрагменти с 4,1 пъти; LFES предотвратява индуцирана от CKD разграждане на актин (Фигура 1В). След това разгледахме маркери за протеинов синтез. Фосфорилирането на целта на рапамицин при бозайници (mTOR) е значително намалено в мускулите на мишки с ХБН спрямо фалшиви мишки. LFES обърна потискането на p-mTOR, което доведе до нива на p-mTOR, които бяха 2 пъти по-високи в групата на CKD/LFES спрямо групата на CKD. LFES също така предотвратява индуцирана от CKD депресия p-p70S6K (Фигура 1C). Тези данни показват, че LFES увеличава синтеза на мускулен протеин и намалява индуцирания от ХБН катаболизъм на мускулния протеин.

LFES променя израза на myomiRs. Общата РНК беше изолирана от комбинирани мускули на гастрокнемиус и екстензор digitorum longus на контролни и LFES мишки и след това беше анализирана за експресия на myomiRs. експресиите на miR-1 (□), miR-206 (X) и miR-133a (Δ) бяха измерени преди (Ctrl) и ежедневно след LFES чрез qPCR с усилени с LNA олигонуклеотидни праймери. Графиката показва експресията на myomiRs при третирани с LFES мишки, изразени като промяна в пъти на контролите (без LFES; настроена за 1-кратна). Оста x представя времето след LFES, а ден 0 показва веднага след LFES. Резултатите се нормализират до U6 РНК (n = 9 двойки). LNA, заключена нуклеинова киселина. # P 5,24–26 В това проучване открихме, че LFES повишава регулирането на локалния IGF-1 и по този начин осигурява средство за увеличаване на мускулната маса и функция. Има четири доказателства в подкрепа на това заключение. Първо, IGF-1 и MGF са значително увеличени в мускулите на третирани с LFES мишки (Фигура 3). Второ, LFES предотвратява увеличаването на протеиновия катаболизъм, индуциран от ХБН (Фигура 1, А и В). Трето, LFES предотвратява индуцирано от CKD намаляване на маркерите за синтез на мускулен протеин (Фигура 1C). Четвърто, LFES стимулира производството на биомаркери за мускулна регенерация и увеличава миграцията на сателитни клетки (Фигура 2). Въпреки това, действителният протеинов синтез и общия протеинов катаболизъм не са измерени в това проучване.

Има два механизма, чрез които LFES повишава регулирането на IGF-1. LFES причинява временен възпалителен отговор, посочен от високи нива на IL-6 и IFN-γ, и причинява преходно намаляване на myomiRs, което води до повишен IGF-1.

Установихме, че LFES причинява временно остро явление на възпалението, което се показва от рязко повишена IL-6 и IFN-γ иРНК непосредствено след LFES. Тези нива намаляват през първите 24 часа и се връщат към нормалните нива в рамките на 48 часа. Възпалението е често срещан физиологичен отговор на упражненията и води до повишена мускулна маса. Показано е, че 27 нокаутиращи мишки IL-6 имат нарушен хипертрофичен отговор на претоварване. 28 По-рано съобщавахме, че реакцията на миогенезата към мускулно увреждане е притъпена при нокаутиращи мишки IL-6, 29 което доказа положителния ефект на IL-6 върху миогенезата. Други групи също съобщават, че електрическата стимулация увеличава IL-6 както в култивираните клетки C2C12 30, така и в човешките първични мускулни клетки. 31,32 При пациенти с ХБН, Caglar et al. 33 установяват, че повишаването на концентрацията на IL-6 е умерено по време на хемодиализа (14%), но че нивата се увеличават драстично в края на 2-часовия постхемодиализен период (68% по-високи в сравнение с изходното ниво).

LFES имитира упражнение за съпротива. Упражнението увеличава мускулната маса, отчасти, чрез активиране на макрофагите. 34,35 Видът на макрофага, участващ в отговора на макрофага, зависи от тяхната функция. Макрофагите-убийци на М1 участват във фагоцитоза или срещат микроби, което води до трайно възпаление. Другите макрофаги за възстановяване на М2 са по-тясно свързани с възстановителните функции и са склонни да ограничават или обръщат възпалението. 23 Установихме, че М1 маркерът, IL-1β иРНК, се увеличава за 24 часа и намалява на ден 3 след LFES. М2 маркерът аргиназа-1 се увеличава на ден 2 и остава на високо ниво на ден 3 след LFES. Времевият ход на високото ниво на аргиназа-1 е успореден на времевия ход за високи нива на IGF-1, което ни кара да предположим, че натрупването на M2 макрофаги води до повишено регулиране на IGF-1.

IGF-1 се произвежда предимно от черния дроб. Няколко проучвания категорично предполагат, че макрофагите са основен екстрахепатален източник на IGF-1. 21,36–38 В модел на нараняване на животни, Lu et al. 36 установи, че макрофагите от подтипа Ly-6C (-) се натрупват в увредения мускул и произвеждат високо ниво на IGF-1 за насърчаване на мускулната регенерация. В проучване при хора IGF-1 е замесен в патогенезата на идиопатичната белодробна фиброза и интерстициалните макрофаги са идентифицирани като източник на IGF-1. 37 В нашето проучване установихме, че IGF-1 и MGF са увеличени в мускулите от LFES, но не и в кръвообращението (серум). Също така установихме, че броят на макрофагите е увеличен в третирания с LFES мускул и че M2 макрофагите се колокализират с IGF-1, което показва, че IGF-1 се произвежда локално от M2 макрофаги.

Ефектът на IL-6 върху IGF-1 е противоречив. Много проучвания, включително тези от нашата група, установиха, че IL-6 отрицателно регулира метаболизма на мускулните протеини чрез понижаване на регулирането на IGF-1. 39 Raj et al. 40 показва, че нивата на IL-6 са били повишени по време на мускулния протеинов катаболизъм при пациенти на хемодиализа. В това проучване установихме, че IL-6 временно се повишава след LFES. Това увеличаване на IL-6 може да улесни локалната инфилтрация на М2 макрофаги, които произвеждат противовъзпалителни цитокини, които от своя страна повишават местното производство на IGF-1. Устойчивото увеличаване на IL-6 в дългосрочен план постоянно би индуцирало M1 макрофагите да произвеждат възпалителни цитокини, което води до понижаване на регулацията на IGF-1 сигнализиране и повишено разграждане на мускулния протеин. Увеличението на IL-6 обаче е преходно, което води само до благоприятното набиране на М2 макрофагите.

Откриването на miRs увеличи знанията ни за контролиране на метаболизма и функцията на скелетните мускули. myomiRs, като miR-1 и miR-206, обикновено причиняват намаляване на нивата на IGF-1. Както miR-1, така и miR-206 са насочени към 3 'нетранслиран регион на IGF-1 и инхибират неговата транслация, което води до намалено количество IGF-1 протеин. 41,42 Това проучване показва, че тези два myomiRs са намалени в мускулите на CKD мишки в ранния период след LFES, което може, заедно с макрофаги-медиирана стимулация, да допринесе за регулирането на IGF-1.

Също така открихме, че miR-1 и miR-206 се увеличават в по-късната фаза след LFES. Съобщава се, че myomiRs играят множество роли в контрола на мускулния растеж и диференциацията в скелетните мускули. Както miR-1, така и miR-206 директно се насочват към Pax3 и Pax7 и запалват миогенната програма. 43 Нашето проучване показа, че miR-1 и miR-206 са увеличени от LFES и остават повишени в мускулите на мишки с ХБН за продължителен период, което може да бъде свързано с повишена миогенеза. Подробностите за ефекта на LFES върху myomiRs обаче се нуждаят от допълнително проучване. Дали промяната на myomiRs се регулира от възпалителни цитокини е друга интересна тема за бъдещи изследвания.

В заключение LFES подобри атрофията на скелетната мускулатура, предизвикана от ХБН, чрез подобряване на метаболитния статус на мускулния протеин и капацитета за мускулна регенерация, което води до повишена мускулна маса и функция. Както увеличаването на протеиновия метаболизъм, така и миогенезата са резултат от подобряване на сигналния път на инсулин/IGF-1. В това проучване ние предоставихме доказателства, които предполагат, че LFES подобрява метаболизма на мускулните протеини и миогенезата чрез увеличаване на IGF-1 чрез два потенциални механизма: (1) намаляване на myomiRs в ранната фаза на отговор и (2) натрупване на M2 макрофаги в по-късния отговор фаза.

Кратки методи

Животни и ХБН Модел

Експериментите с животински модел на CKD и LFES са одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните към университета Емори. ХБН се предизвиква чрез 5/6 нефректомия. 44 Първоначално мишките бяха хранени по двойки с фиктивна фиктивна или CKD мишка с 14% протеинова чау в продължение на 1 седмица и след това с високо протеинова диета (40% протеин) за допълнителна 1 седмица. BUN се измерва скоростта на превръщане на NADH в NAD, наблюдавана при 340 nm, като се използва BUN Kinetic Procedure Kit (Thermo Electron, Louisville, CO).

Мускулната функция беше измерена с помощта на измервател на силата на захващане на мишката с двойни компютъризирани сензори за откриване и записване на силата на сцепление (Columbus Instruments, Columbus, OH). Мишките бяха оставени да хванат решетка, свързана към преобразувател на сила и внимателно издърпани за опашката за 5 секунди. Компютъризираните сензори определят каква сила е необходима, за да компенсира сцеплението на мишките. Мишките бяха тествани преди операцията на ХБН (изходно ниво) и преди и след LFES. Силата на сцепление на всяка мишка беше тествана пет пъти при всеки случай на тестване, с 10 минути почивка между всеки тест. Отчетена е средната стойност на петте определяния.

Лечение с LFES

Мишките бяха държани в специално проектирана система за обезопасяване без упойка, така че да останат в легнало положение по време на лечението с LFES. Избраните точки за акупунктура са съгласно Стандартната номенклатура на акупунктурата на Световната здравна организация. 45,46 Положителната точка (GB34, Yang Ling Quan) е под предната глава на фибулата на около 6 mm (20-g мишка) от повърхностния фибуларен нерв и дълбокия фибуларен нерв. Отрицателната точка (ST36, Zu San Li) е извън колянната става под главата на фибулата на около 7 mm от фибуларния нерв. Иглите бяха свързани в електронен апарат за акупунктура SDZ-II, като се използва постоянен импулс, електрическа честота 20 Hz и електрически ток 1 mA. LFES се прилага за 15 минути всеки ден в продължение на 15 дни след втората нефректомия. Използвани са стерилни игли за еднократна употреба с диаметър 0,25 mm (Shen Li Medical & Health Material Co., Ltd., Wujiang, China).

Western Blot и антитела

Мускулите на задните крайници се хомогенизират в нежен лизисен буфер. 47 Протеините бяха подложени на Western blot анализ, използвайки предварително публикувани методи. 19 Първични антитела (разреждане 1: 1000, освен когато е посочено), които използвахме, включваха Akt/p-Akt (Ser473), FoxO1/p-FoxO1 (Thr32), FoxO3/p-FoxO3 (Thr32), mTOR/p-mTOR (Ser2448 ) и 70S6K/p-p70S6K (Thr389) и бяха от технологията за клетъчна сигнализация. MyoD, Myogenin и eMyHC са от DSHB Product (University of Iowa, Lows, IA). pTEN (FL-403) е от биотехнологията на Санта Круз (Санта Круз, Калифорния); глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназата е от EMD Millipore (Burlington, MA). Протеиновите ленти бяха сканирани и количествено определени с помощта на инфрачервената сканираща система Li-Cor Odyssey (Li-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Мускулна имунохистология

Мускулите бяха вградени в TBS Tissue Freezing Media (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) в изопентан, охладен в сух лед. Методът за имунохистология на мускулни напречни сечения е описан по-рано. 48 Положителните клетъчни числа от поне 500 отделни миофибри на мускул са измерени с помощта на Micro-Suite Five Biologic Software (Olympus, Melville, NY).

Употреба на антитела

Anti-F4/80 е от Abcam, Inc. (Cambridge, MA); anti-Mac-2 и anti-arginase-1 са от Santa Cruz Biotechnology. Поликлонални анти-ламинини антитела (разреждане 1:50; L9393; Sigma-Aldrich) и кози антимишки IGF-1 са от Lifespan Bioscience (Сиатъл, Вашингтон).

Количествено измерване на миши IGF-1 в серум и мускулен лизис

Комплектът ELISA за мишка IGF-1 (ab100695) е предназначен от Abcam, Inc. и е използван в съответствие с инструкциите на производителя.

Обратна транскрипция и qPCR

Общата РНК се екстрахира с използване на триреагент (Molecular Research Inc., Cincinnati, OH). РНК се подлага на обратна транскрипция и qPCR, използвайки предварително публикувани методи. 47 Праймерите са проектирани да пресичат границите на интрон-екзон, както е описано в Таблица 3. За myomiRs, miRCURY LNA Universal cDNA Synthesis Kit (Exiqon Inc., Woburn, MA) се използва за обратна транскрипция на РНК. Праймерите са проектирани по поръчка на Exiqon Inc. МикРНК LNA микроРНК PCR SYBR Green Master Mix (Exiqon Inc.) е използван за qPCR със следните параметри на цикъла: 95 ° C за 10 минути и 45 цикъла при 95 ° C за 10 секунди и 60 ° C за 60 секунди. Експресията на отделни myomiRs беше стандартизирана за гена на мишката U6 и изчислена като разлика между праговите стойности на двата гена (ΔΔcq).

Статистически анализи

Данните бяха представени като средна стойност ± SEM. За да се идентифицират значителни разлики между две групи, бяха направени сравнения с помощта на t теста. Когато се сравняват множество лечения, се извършва ANOVA. Разлики със стойностите на P Griffiths RD

мускулната

: Мускулна маса, оцеляване и възрастен пациент на интензивно отделение. Хранене 12: 456 - 458, 1996 pmid: 8875547