Роли Концептуализация, куриране на данни, разследване, писане - оригинален проект

гъбичната

Институт по хранителна химия и биотехнологии на храните, Университет Justus Liebig Giessen, Giessen, Hesse, Германия

Роли Концептуализация, куриране на данни, придобиване на финансиране, администриране на проекти, надзор, писане - оригинален проект

Институт по хранителна химия и биотехнологии на храните, Университет Юстус Либиг Гисен, Гисен, Хесен, Германия, Институт за молекулярна биология и приложна екология Фраунхофер IME Бизнес зона Биоресурси, Гисен, Хесен, Германия

Фигури

Резюме

Оксилипините са метаболити с различни биологични функции. Биосинтетичният път обаче е широко неизвестен. Смята се, че първата стъпка е оксигенирането на полиненаситени мастни киселини като линолова киселина. Следователно е изследвана липоксигеназа (LOX) от ядливия базидиомицет Agrocybe aegerita. AaeLOX4 беше хетерологично експресиран в Е. coli и пречистен чрез афинитетна хроматография и гел филтрация. Биохимичните свойства и кинетичните параметри на пречистения AaeLOX4 бяха определени с линолова киселина и линоленова киселина като субстрати. Получените стойности на Km, vmax и kcat за линолова киселина са съответно 295,5 μM, 16,5 μM · min -1 · mg -1 и 103,9 s -1. За линоленова киселина се изчисляват стойности на Km, vmax и kcat от 634,2 μM, 19,5 μM · min -1 · mg -1 и 18,3 s -1. Максимални активности се наблюдават при pH 7,5 и 25 ° C. Основният продукт от превръщането на линолова киселина е идентифициран с HPLC с нормална фаза. Този анализ разкрива изрично производство на 13-хидроперокси-9,11-октадекадиенова киселина (13-HPOD). Експерименталната регионална специфичност се подкрепя от аминокиселинните остатъци W384, F450, R594 и V635, считани за важни за регионалната специфичност в LOX. В заключение, HPLC анализ и подравняване разкриха, че AaeLOX4 е 13-LOX.

Цитат: Karrer D, Rühl M (2019) Нова липоксигеназа от гъбичната гъба Agrocybe aegerita: Биохимична характеристика и кинетични свойства. PLoS ONE 14 (6): e0218625. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0218625

Редактор: Daotai Nie, Медицински факултет на Университета на Южен Илинойс, САЩ

Получено: 11 февруари 2019 г .; Прието: 5 юни 2019 г .; Публикувано: 19 юни 2019 г.

Наличност на данни: Генната последователност за AaeLOX4 е достъпна от базата данни GenBank под номер за присъединяване MK451709.

Финансиране: Безвъзмездните средства RU 2137/1 от Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de/en/) бяха предоставени на MR. DK и MR използваха съоръжения на Центъра за биотехнологии и биоресурси LOEWE, финансиран от Министерството на висшето образование, научните изследвания и изкуствата в Хесен (http://www.proloewe.de/en/). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Оксилипините са метаболити, получени от липоксигеназа с разнообразие от различни структури и биологични функции. Тези метаболити могат да бъдат намерени в растения, бозайници, бактерии, водорасли, мъхове и гъби [1]. При бозайниците те участват в регулирането на имунния отговор. През последните години човешки липидни медиатори като напр. Хепоксилини и триоксилини, които играят важна роля в заздравяването на тъканите, защитата на органите, намаляването на болката и защитата на гостоприемника, получиха много внимание [2, 3].

Материали и методи

Клониране и протеинова експресия на AaeLOX4

Оптимизираният за кодон ген AaeLOX4 (Aaelox4), чиято оригинална cDNA е депозирана под номера за присъединяване MK451709, е закупен в търговската мрежа и клониран в плазмида pET28a (BioCat GmbH, Хайделберг, Германия). За експресия на протеин, pET28a/AaeLOX4 плазмид се трансформира в E. coli BL21 (DE3) Gold. Рекомбинантните клетки на Е. coli се култивират в среда с ужасен бульон (TB), съдържаща 12 g триптон, 24 g екстракт от дрожди и 5 g глицерол, допълнени с 50 mg · L -1 канамицин като селекционен маркер, при 37 ° C до OD600 от 0,5 беше достигнато. Експресията се индуцира чрез добавяне на изопропил-р-d-тиогалактопиранозид до крайна концентрация от 0.5 тМ. Температурата на експресия се намалява до 24 ° С и се култивира за още 24 часа. Клетките се събират чрез центрофугиране (4000 g, 30 минути, 4 ° C) и се съхраняват при -20 ° C до по-нататъшна употреба.

Пречистване на протеини

Клетъчната утайка се размразява върху лед и се суспендира отново в лизисен буфер (50 тМ фосфат, 300 тМ NaCl, рН 7,5). Разрушаването на клетките се извършва чрез сонификация (3 цикъла за 60 s, 60 s почивка) върху лед с помощта на сонификатор (Bandelin Sonopuls, Берлин, Германия). След пълно разрушаване клетъчните остатъци се отстраняват чрез центрофугиране (14 000 g, 30 минути, 4 ° С). Получената супернатанта се зарежда два пъти върху 5 ml колона HisTrap (GE-Healthcare), промива се с 5 обема колона лизисен буфер, съдържащ 25 тМ имидазол и се елуира с 5 обема колона със същия буфер, съдържащ 500 тМ имидазол. Гел филтрацията се извършва върху Superdex 200 16/60 (GE Healthcare), като се използва буфер, съдържащ 50 mM Tris (хидроксиметил) аминометан (Tris/HCl), 300 mM NaCl, 10% (v/v) глицерол, pH 7,5 и скорост на потока от 0,2 ml · min -1. Елуирането се събира на 2 ml фракции и се анализира чрез SDS-PAGE. За по-нататъшен анализ бяха използвани фракции с пречистен Aae -LOX4.

Анализ на липоксигеназа

Субстратният разтвор за LOX анализа се приготвя, както следва. 10 μL линолова киселина или линоленова киселина се добавят към 915 μL ddH2O, съдържащи 15 μL Tween 20 и 60 μL 1M NaOH. Аликвотни части се съхраняват при -20 ° C и се размразяват преди употреба. LOX активността се определя чрез записване на образуването на конюгираната двойна връзка при 234 nm (ε = 25 000 М -1 · cm -1) на нанофотометър (Implen, Мюнхен, Германия). Типичната реакционна смес съдържа 0,5 mM линолова киселина, 20 μL ензимен разтвор и 50 mM фосфатен буфер, рН 7,5 до краен обем от 1 ml.

Определяне на рН- и температурен оптимум

За определяне на рН-оптимума са използвани три различни буфера: 50 mM ацетатен буфер, рН 4,5-6; 50 mM фосфатен буфер, pH 6,5–8 и 50 mM боратен буфер, pH 8,5–10. Ефектите от температурата се определят чрез инкубиране на реакционната смес при различни температури, вариращи от 15 ° C - 65 ° C.

Кинетични параметри

Кинетиката на Michaelis-Menten се изчислява чрез инкубиране на пречистен AaeLOX4 с различни концентрации на линолова киселина или линоленова киселина, вариращи от 0,025 mM - 2 mM. Всички измервания се провеждат в 50 тМ фосфатен буфер при рН 7,5 и 25 ° С. Първоначалните скорости на образуване на конюгираната двойна връзка се записват при 234 nm в три екземпляра и се консултират за изчисляване на Km, vmax и kcat.

Анализ на продукта

Продуктовата специфичност на AaeLOX4 се определя чрез инкубиране на 1 mM линолова киселина, 20 μL AaeLOX4 и 50 mM фосфатен буфер, рН 7,5 в краен обем от 1 ml. Напредъкът на реакцията беше последван от запис на образуването на конюгираната двойна връзка при 234 nm. Инкубациите бяха спрени, когато не се установи по-нататъшно увеличаване на изчезването. Получените хидропероксилинолова киселина се екстрахират чрез добавяне на 1 ml н-хексан. За HPLC-анализ екстрактите се сушат под непрекъснат поток N2 и се разтварят в n-хексан/2-пропанол/оцетна киселина (100/5/1, v/v/v). HPLC с нормална фаза се провежда на колона Nucleodur SiOH 100–5 (Macherey-Nagel; 4.6x250 mm, размер на частиците 5 μm) с изократична елуентна система от n-хексан/2-пропанол/оцетна киселина (100/5/1, v/v/v) при скорост на потока 1 mL · min -1. Следва елуиране при 234 nm за хидроперокси мастни киселини и 210 nm за ненаситени мастни киселини. Специфичността на продукта беше оценена чрез сравнение със стандартите 13-HPOD и 9-HPOD, приготвени с търговска соя LOX-1 [10]. Провеждат се контролни експерименти, както е описано по-горе, без добавяне на ензим към реакционната смес.

Резултати

Липоксигенази на гъбата от черна топола Agrocybe aegerita

В наскоро секвенирания геном на Agrocybe aegerita (известен също като Cyclocybe aegerita и Pholiota aegerita), пет гена, кодиращи предполагаеми LOX, са анотирани и обозначени като LOX1 (AAE3_00896), LOX2 (AAE3_01552), LOX3 (AAE3_03654 (AAE3_03654) и LOX5 (AAE3_07753) ([18], www.thines-lab.senckenberg.de/agrocybe_genome). За филогенетичен анализ са използвани дедуцирани аминокиселинни последователности на гени A. aegerita LOX и вече характеризиран гъбичен LOX от Ascomycota (Fusarium oxysporum и Gaeumannomyces graminis) и Basidiomycota (Pleurotus sapidus и Pleurotus ostreatus) (http://www.phylogeny.fr/ параметри по подразбиране). LOX се разделя на две отделни секции с характерния LOX от G. graminis [19] от едната страна и всички базидиомицетни LOX, както и характеризираният LOX от F. oxysporum [20] от другата страна (S1 Фиг.). Последната група се разделя на три части: i) голям клъстер, съдържащ както характеризираните LOXs от вида Pleurotus, така и четири предполагаеми LOXs от A. aegerita (LOX1, LOX2, LOX4, LOX5), ii) LOX3 от A. aegerita и iii) LOX от F. oxysporum.

Хетерологично експресиране и пречистване

Активен и разтворим AaeLOX4 е получен от култури на Е. coli BL21 (DE3) Gold, носещи плазмида pET28a/AaeLOX4. SDS-PAGE анализът на клетъчен лизат показва, че AaeLOX4 присъства във разтворимата лизатна фракция (Фигура 1). По този начин клетъчният лизат се прилага директно върху афинитетна хроматографска колона, което води до отстраняване на суровите примеси. Последващата гел филтрация доведе до чист AaeLOX4 (Фигура 1). Основната лента има приблизително молекулно тегло около 80 kDa, потвърждаващо предвиденото молекулно тегло на аминокиселинната последователност от 79 kDa. Като цяло е получен 1,351-кратен добив от пречистване (Таблица 1).

M = маркер, L = изчистен лизат, AC = пречистване след афинитетна хроматография, GF = пречистен ензим след гел филтрация.

LOX биохимични свойства и характеристики

Активността на AaeLOX4 се определя в температурен диапазон между 15 ° C и 65 ° C. Докато относителната активност от 25 ° C до 45 ° C води до постоянна загуба на около една пета от активността, допълнително повишаване на температурата до 55 ° C причинява драстична загуба на активност и не може да се открие активност при 65 ° C. При най-ниската анализирана температура от 15 ° C остава една трета от максималната LOX активност (Фигура 2).

С увеличаване на рН на буферната система, използвана за тестове за активност на LOX, се получава стабилно усилване на активността, достигащо своя максимум при рН 7,5. По-нататъшното повишаване на рН показа драстична загуба на активност без откриваема активност от рН 9 и по-високо. В киселата среда AaeLOX4 показва по-поносими свойства на активност. Намаляването на рН от 7,5 на 6, води до загуба на около 20% активност. Независимо от това, при pH 5.0 относителната активност намалява до 50%, докато 20% относителна активност остава при pH 4.5 (Фигура 3).

50 mM ацетатен буфер (квадрати), 50 mM фосфатен буфер (кръгове), 50 mM боратен буфер (триъгълници).

Параметрите на Michaelis-Menten бяха изведени въз основа на графика Lineweaver-Burk, изобразяваща активността на AaeLOX4 с концентрации на линолова киселина или линоленова киселина между 0,025–2 mM (Фигура 4). Получените стойности на Km, vmax и kcat за линолова киселина са съответно 295,5 μM, 16,5 μM min -1 mg -1 и 103,9 s -1. За линоленова киселина като субстрат се изчисляват стойности на Km, vmax и kcat от 634,2 μM, 19,5 μM · min -1 · mg -1 и 18,3 s -1 (Таблица 2). Субстратната специфичност на AaeLOX4 е оценена чрез сравняване на относителните активности спрямо различни PUFA (Таблица 3). Ензимът показва най-висока специфичност за линолова киселина и висока относителна активност за линоленова киселина (88,8%). Арахидоновата киселина обаче показа най-ниска относителна активност със 7,3%.

Стойностите представляват средствата за трикратни повторения и тяхното стандартно отклонение. Inset представлява Lineweaver-Burk сюжет.

HPLC-анализ на продукти

Специфичността на AaeLOX4 се анализира чрез HPLC с нормална фаза. Профилът на елуиране на AaeLOX4 показва два основни продукта, които се елуират за 3.12 минути и 3.81 минути (Фигура 5). 13-Z, E-HPOD и 13-E, E-HPOD, както и 9-Z, E-HPOD и 9-E, E-HPOD са приготвени със соя LOX-1 според Kuribayashi et al. [10]. 13-Z, E-HPOD и 13-E, E-HPOD се елюират съответно при 3.33 минути и 3.79 минути, докато изомерната 9-HPOD смес се елуира като един пик при 5.79 минути. Отрицателната контрола не показва пикове в тези времена на задържане. Сравнението между продуктите AaeLOX4 и продуктите LOX-1 от соя разкри, че AaeLOX4 произвежда силно специфичен 13-HPOD. Производството на 9-HPOD от AaeLOX4 не беше открито и изключено чрез сравняване на UV-спектрите на 9-HPOD, елуиращи се на 5,79 минути от соя LOX-1 с пикове в този диапазон в профила на елуиране на продуктите AaeLOX4.

Хроматограмата се записва при 234 nm. (А) отрицателен контрол. Екстракт от реакционната смес без ензим. (Б) Екстракт от реакционните продукти от соя LOX-1. (C) Екстракт от реакционните продукти от AaeLOX4. (1a) 13-Z, E-HPOD, (1b) 13-E, E-HPOD, (2) 9-Z, E-HPOD + 9-E, E-HPOD.

Дискусия

Подкрепяща информация

S1 Фиг. Филогенетичен анализ на различни гъбични LOX.

Aae — Agrocybe aegerita, Fox — Fusarium oxysporum, Ggr — Gaeumannomyces graminis, Pos — Pleurotus ostreatus, Psa — Pleurotus sapidus; AaeLOX1, AaeLOX2, AaeLOX3, AaeLOX4 (MK451709), AaeLOX5, FoxLOX (KNB01601), GgrLOX (AAK81882), PsaLOX (CCV01580), PosLOX (CCV01578).

S2 Фиг. Частично подравняване на аминокиселинната последователност на различни LOX.

Agrocybe aegerita AaeLOX1, AaeLOX2, AaeLOX3, AaeLOX4, AaeLOX5, Pleurotus sapidus PsaLOX, Pleurotus ostreatus PosLOX, Fusarium oxysporum FoxLOX, Gaeumannomyces graminis GG Подравняването беше извършено чрез използване на Clustal Omega с параметри по подразбиране. Осветените аминокиселинни остатъци, участващи в свързването на лиганда, са посочени като „L“. Свързаните със стерео специфичността аминокиселини са посочени като „B“ [24], „H“ [27] и „S“ [23].

Благодарности

Бихме искали да благодарим на анонимния рецензент за предоставянето на ценна обратна връзка, която помогна за подобряването на статията.