Резюме

Предистория/цел

Ролята на микробиома е широко обсъждана в етиологията на апендицита. Основната цел беше да се оцени микробиома в нормалния апендикс и при апендицит, специално разделен на трите клинично и хистопатологично дефинирани степени на възпаление. Вторичните цели бяха да се изследва дали има някакви микробиомни разлики между проксималните и дисталните придатъци и да се свърже микробиома с хистопатологичните находки.

Методи

Проведено е проспективно пилотно проучване на деца, подложени на апендектомия за апендицит. Диагнозата се основава на хистопатологичен анализ. Децата с инцидентна апендектомия бяха използвани като контроли. Проксималната и дисталната лигавица от допълненията бяха анализирани с 16S rRNA генно секвениране.

Резултати

Общо 22 деца, 3 контроли и 19 пациенти с апендицит; Включени са 11 флегмонозни, 4 гангренозни и 4 перфорирани приложения. Размерът на Fusobacterium увеличен и Бактероиди намалява при флегмонозен и перфориран апендицит в сравнение с контролите, но не се достига статистическа значимост и този модел не се наблюдава при гангренозен апендицит. Не може да се види връзка между различните бактерии и степента на възпаление и има голямо разнообразие в изобилието на ниво, род и вид във всяка конкретна група пациенти. Освен това не могат да бъдат открити значителни разлики при сравняване на микробиома в проксималната и дисталната лигавица, което може да се дължи на недостатъчното проучване. Тенденция с по-голямо количество Fusobacteria в дисталната лигавица се наблюдава при пациенти с апендицит с обструкция (съответно 25 и 13%), стр = 0,06).

Заключение

Моделът на микробиома се различава не само между групите, но и в рамките на групите. Въпреки това не могат да бъдат открити статистически значими разлики в микробиома между групите или клиничните състояния. Не е установена връзка между конкретна бактерия и степен на възпаление. В по-голямата част от случаите на апендицит промени в микробиома не изглежда да са основното събитие. Тъй като изглежда, че има разлики в моделите на микробиомите в зависимост от мястото на вземане на пробата, точната локализация на вземането на проби от биопсия трябва да бъде описана в бъдещи проучвания.

Въведение

Апендицитът е често срещано заболяване сред деца и възрастни, с риск за живота от 7% [1]. Въпреки че първата апендектомия е извършена преди повече от 130 години [2], физиологичната функция на апендикса и патогенезата на апендицита не са напълно изяснени.

Има няколко предложени причини за развитието на апендицит, но най-честото обяснение на първичното събитие е запушване на лумена с последващо натрупване на секрети, повишаване на интралуминалното налягане, увреждане на лимфния и венозен дренаж, нарушена лигавична бариера и свръхрастеж и инвазия на микроби в апендицеалната стена [3–6]. Съобщава се обаче, че обструкция поради фекалити, анатомично местоположение, лимфоидна хиперплазия, чужди тела и тумори се открива само в около една трета от всички случаи [7–9]. Интралумалното налягане не се повишава при проспективно проучване [7]. В обобщение, ясно е, че теорията с запушване на лумена не може да обясни по-голямата част от всички случаи на апендицит [10] и следователно теорията за свръхрастеж и инвазия на микроби, вторична за обструкцията, е слаба. Вместо това има доклади, указващи за първично инфекциозно събитие [11], и едно проучване, докладвано за апендицит, появяващ се в клъстери [12]. Има и съобщения за сезонна вариация на честотата на остър апендицит [13, 14].

Въпреки несигурността по отношение на последователността на събитията, водещи до развитието на апендицит, се предполага, че микробиомът в апендикса има централна роля в патогенезата [11, 15–18]. Повечето предишни проучвания са използвали конвенционални културни техники за оценка на ролята на бактериите при остър апендицит [19, 20]. Тази техника е ефективна при оценката на единични бактериални видове, но липсва способността да се характеризира полимикробното разнообразие [11]. С тези конвенционални методи за култивиране се пропускат до 90–99% от микробите [21]. За да се оцени микробното разнообразие, трябва да се извърши 16S rRNA генно изследване на микробиотата на апендикса [22].

материали и методи

Изследването е проведено съгласно Декларацията от Хелзинки и одобрено от Регионалния съвет за етичен преглед (регистрационен номер 2013/614) и от Регионалния център за биобанки (ID на колекция SC1956). Данните бяха анонимизирани преди изчисленията и са представени по такъв начин, че е невъзможно да се идентифицира нито един пациент. На болногледачите е дадена писмена и устна информация за изследването преди да дадат съгласието си.

Настройки и деца

Всички деца бяха оперирани във висш център по детска хирургия от август 2013 г. до юли 2014 г. Центърът обслужва район с 340 000 жители с първична хирургична помощ за деца

Резултати

Характеристики на пациента

Микробиомни анализи

Типово ниво

На ниво филум бяха открити десет различни фили. Във всички групи бяха представени пет фила с присъствие> 2%, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes, Fusobacteria и Proteobacteria; като има предвид, че филите Spirochaetes, Cyanobacteria, Synergistetes, Tenericutes и Verrucomicrobia, всички са имали присъствие на фиг. 1

микробиома

Микробиомен анализ на ниво филум на дисталната лигавица при пациенти с различни степени на апендицит в сравнение с контролната група. Фила с присъствие> 2%, включена във фигурата

Ниво на рода

На ниво род в приложенията са намерени общо 80 рода. Само пет рода са имали> 5%; Athrobacter, Бактероиди, Порфиромонас, Парвимонас, и Fusobacterium в която и да е от изследваните групи. Само в контролите Бактероиди (24%) присъства в> 5%. При флегмонозен апендицит, Fusobacterium (19%), Athrobacter (17%) и Бактероиди (12%) са в изобилие. Гангренозният апендицит е подобен на контролите с Бактероиди с голямо изобилие (23%), но с добавяне на Порфиромонас (8%) с изобилие> 5%. При перфориран апендицит пет рода са имали> 5% с Fusobacterium (32%) и Athrobacter (22%) в мнозинство (фиг. 2). Не са открити статистически значими разлики в изобилието на описаното по-горе ниво на рода (данните не са показани). Когато се разглеждат различните нива на родовете при пациенти във всяка отделна група (например различна тежест на апендицит и контролни групи), има голямо разнообразие на изобилието във всяка конкретна група. Следователно, пациентите със същата тежест на апендицит са имали много различни нива от различните родове (данните не са показани).

Микробиомен анализ на ниво род на дисталната лигавица при пациенти с различни степени на апендицит в сравнение с контролна група. Род с присъствие> 5%, включен във фигурата

Използвайки инструмента за биоинформатика LEfSe, ние допълнително разследвахме дали апендицитът може да бъде свързан с някакъв бактериален вид, но не е имало разлика на видово ниво между групите, и както при анализите на ниво тип и пол, се забелязва голяма вариация (данните не показано).

Сравнения на микробиота според хистопатологията

При сравняване на проксималната лигавица и дисталната лигавица не са установени статистически значими разлики на ниво тип или род (данните не са показани). На ниво филум при флегмонозен и перфориран апендицит, Fusobacteria има присъствие в проксималната лигавица съответно от 3 и 24%, в сравнение с 36 и 57%, съответно, в дисталната лигавица. Съответните числа за Bacteroidetes са съответно 45 и 26% в проксималната лигавица и съответно 38 и 21% в дисталната лигавица (фиг. 3).

Микробиомен анализ на ниво фикс на проксимална и дистална лигавица при различни степени на апендицит и контроли

Няма разлика в нивата на филум на проксималната лигавица между пациенти с апендицит със или без макроскопско възпаление на това място (данните не са показани). Когато се сравняват нивата на филум в дисталната лигавица между пациенти с апендицит със или без обструкция (апендиколит), се наблюдава тенденция към по-голямо изобилие от фузобактерии при пациенти с обструкция (съответно 25 и 13%), стр = 0,06). Не са забелязани разлики за други видове (данните не са показани).

Не се установява статистическа значимост при оценяване на богатството на таксоните, но се наблюдава тенденция при здрави придатъци и проксимални проби с по-високо α-разнообразие. Дисталните проби от перфориран апендицит имат най-малко микробно разнообразие (фиг. 4). Непретеглените и претеглени показатели на Unifrac не показват значимо групиране на групите в основен координатен анализ (данните не са показани).

Алфа-разнообразие при пациенти с различни степени на апендицит и контроли. Алфа-разнообразието беше изследвано с филогенетично разнообразие (PD цяло дърво) и наблюдавани индекси на видове (данните не са показани) при равномерна дълбочина на вземане на проби от 4831 последователности/проба. Стойностите, представени като средна стойност ± SD. Не са установени значителни разлики между групите

Дискусия

Това беше първото проучване за оценка на микробиома във всичките три клинично дефинирани стадия на апендицит и във връзка с различни места и клинични състояния. На групово ниво могат да се видят отчетливи разлики в съдържанието на филум и род при сравняване на контролите с трите групи на апендицит. Въпреки това, имаше голяма вариация на изобилието във всяка конкретна група, което може да обясни липсата на значителни разлики, наблюдавани по време на проучването. Имаше и вариация в микробиома между проксималната и дисталната лигавица във всяка група. Единствената разлика, която обикновено е статистически значима, е изобилието от Fusobacteria дистално до обструкция.

Fusobacterium увеличен в изобилие при флегмонозен и особено перфориран апендицит в сравнение с контролите. Имаше обаче присъствие на

Заключение

Моделът на микробиома се различава не само между групите, но и в рамките на групите. Въпреки това не могат да бъдат открити статистически значими разлики в микробиома между групите или клиничните състояния. Не е установена връзка между конкретна бактерия и степен на възпаление. В по-голямата част от случаите на апендицит промени в микробиома не изглежда да са основното събитие. Тъй като изглежда, че има разлики в моделите на микробиоми в зависимост от мястото на вземане на пробата, точната локализация на вземането на проби от биопсия трябва да бъде описана в бъдещи проучвания.

Изявления на сътрудниците

Мартин Сальо: проектира протокола за изследване, събира клиничните и лабораторни данни, изготвя първоначалния ръкопис, критично преглежда ръкописа и одобрява окончателния ръкопис, както е представен.

Nittaya Marungruang: съдейства за анализ и биоинформатична обработка на данните за микробиотата, прегледа критично ръкописа и одобри окончателния ръкопис, както е представен.

Tiaa Sundberg: извърши 16S rRNA генно секвениране на микробиотата, прегледа критично ръкописа и одобри окончателния ръкопис, както е представен.

Бодил Рот: извърши 16S rRNA генно секвениране на микробиотата, прегледа критично ръкописа и одобри окончателния ръкопис, както е представен.

Pernilla Stenström: ръководи събирането на данни, преглежда критично ръкописа и одобрява окончателния ръкопис, както е представен.

Einar Arnbjörnsson: проектира проучването, прегледа критично ръкописа и одобри окончателния ръкопис, както е представен.

Фрида Фок: подпомага биоинформатичната обработка на данните за микробиотата, преглежда критично ръкописа и одобрява окончателния ръкопис, както е представен.

Бодил Олсон: проектира проучването, наблюдава статистическите изчисления, критично преглежда ръкописа и одобрява окончателния ръкопис, както е представен.

Всички автори одобриха окончателния ръкопис, както е представен, и се съгласиха да отговарят за всички аспекти на работата.

Препратки

Addiss DG, Shaffer N, Fowler BS, Tauxe RV (1990) Епидемиологията на апендицит и апендектомия в Съединените щати. Am J Epidemiol 132 (5): 910–925

Hutchinson R (1993) Amyand’s hernia. J R Soc Med 86 (2): 104–105

Bundy DG, Byerley JS, Liles EA, Perrin EM, Katznelson J, Rice HE (2007) Има ли това дете апендицит? JAMA 298 (4): 438–451

Walker ASI (1990) Какво причинява апендицит? J Clin Gastroenterol 12 (2): 127–129

Humes DJ, Simpson J (2006) Остър апендицит. BMJ 333 (7567): 530–534

Singh JP, Mariadason JG (2013) Роля на феколита при съвременния апендицит. Ann R Coll Surg Engl 95 (1): 48–51

Arnbjörnsson E, Bengmark S (1984) Роля на обструкцията в патогенезата на острия апендицит. Am J Surg 147: 390–392

Jones BA, Demetriades D, Segal I, Burkitt DP (1985) Преобладаването на апендицеалните фекалити при пациенти със и без апендицит. Сравнително проучване от Канада и Южна Африка. Ann Surg 202 (1): 80–82

Chang AR (1981) Анализ на патологията на 3003 приложения. Aust N Z J Surg 51 (2): 169–178

Carr NJ (2000) Патологията на острия апендицит. Ann Diagn Pathol 4 (1): 46–58

Swidsinski A, Dörffel Y, Loening-Baucke V, Theissig F, Rückert JC, Ismail M, et al. (2011) Острият апендицит се характеризира с локална инвазия с fusobacterium nucleatum/necrophorum. Черва 60 (1): 34–40

Andersson R, Hugander A, Thulin A, Nystrom PO, Olaison G (1995) Клъстери на остър апендицит - допълнителни доказателства за инфекциозна етиология. Int J Epidemiol: 829–833

Deng Y, Chang DC, Zhang Y, Webb J, Gabre-Kidan A, Abdullah F (2010) Сезонни и ден от седмицата вариации на перфориран апендицит при деца в САЩ. Pediatr Surg Int 26 (7): 691–696

Zangbar B, Rhee P, Pandit V, Hsu C-H, Khalil M, Okeefe T, et al. (2015) Сезонни вариации в спешната обща хирургия. Ан Сург

Guinane CM, Tadrous A, Fouhy F, Ryan CA, Dempsey EM, Murphy B, et al. (2013) Микробен състав на човешките придатъци от пациенти след апендектомия. MBio 4 (1): e00366–12

Jackson HT, Mongodin EF, Davenport KP, Fraser CM, Sandler AD, Zeichner SL (2014) Независима от културата оценка на микробиомите на апендикса и ректума при деца със и без апендицит. PLoS One 9 (4): e95414

Swidsinski A, Loening-Baucke V, Biche-ool S, Guo Y, Dörffel Y, Tertychnyy A, et al. (2012) Инвазията на лигавицата от фузобактерии е често срещана характеристика на острия апендицит в Германия, Русия и Китай. Saudi J Gastroenterol 18 (1): 55

Zhong D, Brower-Sinning R, Firek B, Morowitz MJ (2014) Острият апендицит при деца е свързан с изобилие от бактерии от типа fusobacteria. J Pediatr Surg 49 (3): 441–446

Leigh DA, Simmons K, Norman E (1974) Бактериална флора на апендиксната ямка при апендицит и инфекция на следоперативна рана. J Clin Pathol 27: 997–1000

Робъртс JP (1988) Количествена бактериална флора на остър апендицит. Arch Dis Child 63 (5): 536–540

Hugenholtz P, Goebel BM, Pace NR (1998) Въздействие на независими от културата изследвания върху възникващия филогенетичен възглед за бактериалното разнообразие (Journal of Bacteriology (1998) 180: 18 (4765–4774)). J Бактериол. стр. 6793.

Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M, et al. (2005) Разнообразие на чревната микробна флора на човека. Science 308 (5728): 1635–1638

Samuel M (2002) Резултат от детски апендицит. J Pediatr Surg 37 (6): 877–881

Peter SDS, Sharp SW, Holcomb GW, Ostlie DJ (2008) Дефиниция, основана на доказателства за перфориран апендицит, получена от проспективно рандомизирано проучване. J Pediatr Surg 43 (12): 2242–2245

Andersson R (1998) Апендицит - епидемиология и диагностика. Теза. Университет Линчепинг, Швеция

Emil S, Gaied F, Lo A, Laberge JM, Puligandla P, Shaw K, et al. (2012) Гангренозен апендицит при деца: проспективна оценка на дефиницията, бактериологията, хистопатологията и резултатите. J Surg Res 177 (1): 123–126

Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, et al. (2010) QIIME позволява анализ на данни за последователност на общността с висока производителност. Nat Methods 7 (5): 335–336

Benjamini Y, Hochberg Y, Benjamini Y, Hochberg Y (1995) Контролиране на процента на фалшивите открития: практичен и мощен подход към множество тестове. J R Stat Soc B 57 (1): 289–300

Clarke KR (1993) Непараметрични многовариантни анализи на промените в структурата на общността. Aust J Ecol 18: 117–143

Segata N, Izard J, Waldron L, Gevers D, Miropolsky L, Garrett WS, et al. (2011) Откриване и обяснение на метагеномния биомаркер. Геном Biol 12 (6): R60

Bolstad AI, Jensen HB, Bakken V (1996) Таксономия, биология и периодонтални аспекти на fusobacterium nucleatum. Clin Microbiol Rev 9 (1): 55–71

Andersson RE, Olaison G, Tysk C, Ekbom A (2001) Апендектомия и защита срещу улцерозен колит. N Engl J Med 344 (11): 808–814

Radford-Smith GL, Edwards JE, Purdie DM, Pandeya N, Watson M, Martin NG, et al. (2002) Защитна роля на апендицектомия при появата и тежестта на улцерозен колит и болест на Crohn. Черва 51 (6): 808–813

Strauss J, Kaplan GG, Beck PL, Rioux K, Panaccione R, Devinney R, et al. (2011) Инвазивният потенциал на получена от чревна лигавица fusobacterium nucleatum положително корелира със статуса на IBD на гостоприемника. Възпаление на червата Dis 17 (9): 1971–1978

Docktor MJ, Paster BJ, Abramowicz S, Ingram J, Wang YE, Correll M, et al. (2012) Промени в разнообразието на оралния микробиом при детска възпалителна болест на червата. Възпаление на червата Dis 18 (5): 935–942

Falcony G, Joossens M, Vieira-Silva S, Wang J, Darzi Y, Faust K, et al. (2016) Анализ на ниво популация на вариацията на чревния микробиом. Наука (80-) 352 (6285): 560–564

Zhernakova A, Kurilshikov A, Bonder MJ, Tigchelaar EF, Schirmer M, Vatanen T, et al. (2016) Базираният на популация анализ на метагеномиката разкрива маркери за чревния микробиомен състав и разнообразие. Наука (80-) 352 (6285): 565–569