Резюме

β-клетките реагират на периферна инсулинова резистентност чрез увеличаване на циркулиращия инсулин при ранен диабет тип 2 (T2D). Ремоделирането на островчета поддържа тази компенсация, но двигателите на този процес остават слабо разбрани. Инфилтриращите макрофаги са замесени в късния стадий на T2D, но е известно сравнително малко за макрофагите, обитаващи островчета, особено в ранния T2D. Предполагаме, че макрофагите, пребиваващи на островчета, допринасят за ремоделиране на съдови острови и хиперинсулинемия, чийто неуспех води до бързо прогресиране до T2D. Използвайки генетични и индуцирани от диетата модели на компенсаторна хиперинсулинемия, ние показваме, че нейното изчерпване значително компрометира ремоделирането на островчета по отношение на размера, съдовата плътност и способността за секреция на инсулин. Изчерпването на островните макрофаги намалява секрецията на VEGF-A както от човешки, така и от миши острови ex vivo и въздействието на намалената VEGF-A функционално се превежда до забавена реваскуларизация при трансплантация in vivo. Следователно, ние показваме нова роля на макрофагите, пребиваващи на островчета, в контекста на ранния T2D и предполагаме, че има значителна полезност при използването на островни макрофаги за насърчаване на ремоделирането на островчета и способността за секреция на инсулин на островчета.

островните

Акценти

Компенсаторната хиперинсулинемична фаза на диабет тип 2 е придружена от значително преустройство на панкреатичните островчета.

Макрофагите, пребиваващи в добросъвестни островчета, се увеличават по време на фазата на компенсиране на диабет чрез голяма пролиферация in situ.

Аблационните макрофаги сериозно компрометират процеса на ремоделиране на островчетата и влошават гликемичния контрол in vivo.

Макрофагите на мишки и човешки островчета допринасят VEGF-A към околната среда на островчетата.

Специфичното отстраняване на островни макрофаги забавя васкуларизацията на островчета при компенсаторни хиперинсулинемични мишки.

Въведение

Въпреки че инсулиновата резистентност се счита за основна характеристика на захарната активност на панкреаса от тип 2 на захарен диабет (T2D) и инсулиновата недостатъчност, остава централна за патогенезата на това заболяване (1). β-клетките първоначално реагират на инсулинова резистентност чрез индуциране на компенсаторен хомеостатичен механизъм, който води до хиперинсулинемия, за да предотврати твърде високи нива на циркулиращата глюкоза. Този адаптивен компенсаторен механизъм в крайна сметка се проваля поради неактивност на бета-клетките на панкреаса (или чрез дисфункция, дедиференциация или апоптотични механизми), водещи до развитието на явен T2D (2). Въпреки че β-клетките произвеждат инсулин, общоприето е, че други съседни типове клетъчни типове играят важна роля в подпомагането и медиирането на подходящ отговор на β-клетките. Удължаването на процеса на компенсация на островчетата, като първо се постигне по-добро разбиране на паракринните фактори, които допринасят за това, е една жизнеспособна стратегия за предотвратяване на инсулинова недостатъчност и патогенезата на T2D.

Макрофагите са основният тип имунни клетки в панкреатичните островчета в стационарно състояние, но тяхното присъствие на островче остава ниско (3). Отдавна се съобщава, че островните макрофаги се увеличават при продължително затлъстяване и при T2D, но функционалните последици от увеличения островен макрофаг винаги са били отрицателни. Тези макрофаги често се разглеждат като основния двигател на възпалението на островчетата и дисфункцията на β-клетките и по този начин директно допринасят за развитието на T2D (4-7). От друга страна, също се съобщава, че островните макрофаги са от съществено значение за образуването на β-клетки по време на ембрионалното развитие, а в експериментални модели на регенерация на β-клетки на панкреаса, е показано, че макрофагите поддържат пролиферацията на β-клетки (8). Тъй като макрофагите са силно пластични с бързи фенотипни адаптации към местната среда, вероятно е островните макрофаги да играят различни роли в двата края на T2D спектъра на патогенезата (9-11).

Досега проучванията върху островни макрофаги са фокусирани върху по-късните етапи на диабетната патогенеза, когато секрецията на инсулин е нарушена. Например, увеличеното натрупване на макрофаги е потвърдено от патологични проучвания, използващи панкреатични островчета от пациенти с T2D (12, 13) и от модели на гризачи за затлъстяване и диабет тип 2 (14, 15). В подкрепа на това фактори като глюколипотоксичност, ендотоксичност и отлагане на амилоиди на островчета са замесени в етапа на набиране на остров в провъзпалителни макрофаги, които движат T2D патогенезата (16-18).

Относително малко са известни островните макрофаги в ранната T2D фаза на умерена хипергликемия и хиперинсулинемия. Последното се улеснява от ремоделиране на островчета и хипертрофия, както и β-клетъчна хиперплазия. С доказателства за участие на макрофаги по време на ембрионалното развитие на панкреаса и тяхното значение за подпомагане на репликацията на β-клетки в експериментални модели на регенерация на панкреаса на гризачи, възможно е островните макрофаги да имат положително въздействие върху функцията на островчетата и β-клетките (8, 19, 20 ). Освен това е показано, че VEGFA-медиираното разширяване на β-клетките изисква повишено присъствие на макрофаги в микросредата на островчетата (21). Тези проучвания заедно намекват за възможна полезна роля, която могат да имат островните макрофаги. Въпреки че е известно в контекста на развитието на панкреаса и регенерацията на β-клетките след нараняване, участието на макрофаги по време на ранните етапи на T2D и β-клетъчната компенсация остава мъгляво (22).

Резултати

По-голям брой макрофаги в островчета на db/db мишки

Известно е, че макрофагите съществуват в панкреатичните островчета в стабилно състояние (23), но тяхната роля в ранния диабет тип 2 все още е относително неизвестна. Тук разгледахме конкретно компенсацията на островчета при млади db/db мишки (на възраст 16 седмици и по-малко) с хипотезата, че островните макрофаги допринасят за островната хипертрофия и β-клетъчната хиперплазия, наблюдавани при мишките на тази възраст (общо наричани островчета ремоделиране). Дефицит на лептин рецептор B6.BKS (D) -Lepr db/J мишка (db/db) има умерено, но значително увеличение на нивата на глюкоза на гладно, значително по-висока екскурзия на глюкоза след интраперитонеална инжекция на глюкоза и по-висока циркулираща инсулин по време на двете състояния, стимулирани на гладно и глюкоза, в сравнение с недиабетични постни кученца (постно) (допълнителна фигура 1A-C). Размерът на островчетата при db/db мишки беше постоянно приблизително 3,5 пъти по-голям в сравнение с постните мишки (допълнителна фигура 1D-E), което потвърждава по-ранно наблюдение (24). Тези резултати са подобни на метаболитните адаптации, наблюдавани при хора преди диабет (1, 25, 26), което прави db/db мишката идеален модел за изучаване на механизмите на компенсация на островчета в началото на T2D.

Макрофагите на човешки и миши островчета допринасят VEGF-A и възпалителни цитокини в местната среда

Изчерпването на макрофаги намалява ремоделирането на островчета и секрецията на инсулин при мишки, хранени с HFD, лекувани с CSF-1R

Установихме наличието на макрофаги в недиабетни човешки островчета и анализът на ex vivo културите предполага, че подобно на миши островчета, редица проинфламаторни цитокини се секретират от островчетата. Успешно изчерпахме макрофагите от човешките островчета, използвайки клодронат ex vivo и забелязахме, че VEGF-A заедно с TNFα значително намаляват. За разлика от мишките островчета, IL-6 е увеличен в изчерпани от макрофаги човешки островчета и това наблюдение е особено интригуващо, тъй като редица проучвания намекват за защитните ефекти на β-клетките на IL-6 (42-44). Независимо от това, подобно на мишите островчета, няма значителна промяна в профила на експресия на гена на β-клетки в човешките островчета, когато макрофагите са изчерпани, подкрепяйки идеята, че островните макрофаги имат по-голямо въздействие върху съдовата система на островчетата в сравнение с прякото въздействие върху β -клетки. По-нататъшни проучвания са оправдани, за да се установи дали функционалните последици от изчерпването на макрофагите при човешките островчета водят до намалена реваскуларизация, както се наблюдава при миши островчета.

Материали и методи

Животни

Хомозиготни диабетни (db/db) мишки и недиабетични контролни носилки на щам на мишка B6.BKS (D) -Leprdb/J са закупени от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME) и се поддържат на 12-часов цикъл светлина/тъмнина с безплатен достъп до храна и вода. Трансгенната линия CD169-DTR е генерирана, както е описано по-горе (51). Мишките бяха строго съпоставени по възраст и пол в рамките на експериментите и с тях се работеше в съответствие с институционалните и националните насоки. С изключение на мишките C57BL/6J, които бяха закупени (InVivos Pte Ltd, Сингапур), всички останали линии бяха държани като размножителни колонии в местни съоръжения за метаболитна оценка при условия, които не са SPF. Всички експерименти с животни са направени с одобрение от институционални и университетски комисии по етика (# 140905, # A0373, # 2013/SHS/816 и # 2018/SHS/1399). За да предизвикат преддиабет, мишките са били хранени или с диета с високо съдържание на мазнини (# D12492, Research Diets Inc, NJ, САЩ), или с диета с ниско съдържание на мазнини, съобразена с калории (# D12450J, Research Diets Inc, NJ, САЩ), съответно. Диетите се съхраняват при -80 ° C и се размразяват до 4 ° C, в продължение на най-малко 24 часа, преди да се предоставят на животните ad libitum.

Изчерпване на макрофаги чрез третиране с клодронат

За да анализираме ролята на макрофагите върху функцията на панкреатичните островчета и секрецията на инсулин по време на компенсация, проведохме in vivo експерименти за изчерпване на макрофагите от островчетата. Накратко, клодронат или PBS, съдържащи липозоми, се прилагат интраперитонеално на 10 седмици db/db или контролни мишки (200 µL; 50 mg/kg телесно тегло; clodronateliposomes.com) и продължават на всеки 3 дни в продължение на 2 седмици. Липозомите съдържат или PBS, или клодронат, нетоксичен бисфосфонат. След инжектиране липозомите се поглъщат и усвояват от макрофаги. Хлоринатът се освобождава и се натрупва вътреклетъчно, където при високи вътреклетъчни концентрации предизвиква апоптоза (52). Животните се умъртвяват на 12 седмици и последната доза клодронат се дава един ден преди жертвата. Животните бяха на гладно през нощта и беше извършен интраперитонеален тест за толерантност към глюкоза. Кръв се събира от опашната вена за определяне на плазмените нива на инсулин. Изрязаният панкреас и островчетата бяха изолирани чрез разграждане на колагеназа и използвани за функционален анализ.

Изчерпване на макрофаги при мишки CD169-DTR

В това проучване бяха използвани общо 23 женски мишки C57BL/6 на възраст 8-9 седмици, от които 12 мишки бяха CD169-DTR положителни (DTR +) и 11 бяха DTR отрицателни (DTR-) контролни мишки. Всички мишки бяха хранени с 60% HFD за 21 дни. Общо 20 µg/kg DT се инжектират интраперитонеално на всеки 3 дни и впоследствие мишките се бракуват за събиране на панкреаса и черния дроб. Взетите тъкани бяха фиксирани в 4% PFA и след това криоконсервирани за имунофлуоресцентни изследвания.

Изчерпване на макрофаги чрез инжектиране на CSF1R срещу мишка

Мишките C57BL/6 на възраст 10 седмици бяха хранени с 60% HFD в продължение на 21 дни. 2 mg антимиши CSF1R (CD115, AFS98) (Bio X Cell, USA) антитяло или PBS контрола се инжектират три пъти в продължение на 21 дни (дни 0, 10 и 20). Тъканите бяха фиксирани в 4% параформалдехид за изследвания на имунофлуоресценция. IPGTT, ITT и плазмените нива на инсулин са измерени на ден 0, 10 и 20.

Тест за толерантност към глюкоза, тест за толерантност към инсулин, тест за секреция на инсулин и освобождаване на инсулин

За тестове за толерантност към глюкоза (GTT), мишките са гладували в продължение на 6–12 часа. След това на мишките се инжектира i.p с 2,0 g/kg телесно тегло глюкоза и 1 U/kg телесно тегло инсулин след 4 часа глад за теста за инсулинов толеранс (ITT). Преди и до 120 минути след инжектирането, концентрацията на глюкоза в кръвта се измерва във венозна кръв (Vena Saphena) с помощта на автоматизиран глюкомер. За теста за секреция на инсулин (IST) се вземат кръвни проби на 0, 15 и 30 минути след инжектиране на глюкоза (2 g глюкоза/kg телесно тегло) за определяне на инсулин чрез ELISA. Островчетата бяха индивидуално дисектирани под стереомикроскоп. Партиди от 10 островчета с подобен размер бяха събрани и инкубирани в RPMI 1640-10% фетален телешки серум при 37 ° C в 5% CO2 за 2 часа. Тези островчета се измиват и предварително се инкубират в 0,5% (тегл./Об.) Говежди серумен албумин-буфериран физиологичен разтвор на Krebs-Ringer HEPES в 2,8 mM глюкоза при 37 ° C в 5% CO2 за 30 минути и след това се прехвърлят в 0,5% (тегл./об.) говежди серумен албумин-Krebs-Ringer HEPES-буфериран физиологичен разтвор в 2.8 mM глюкоза, стимулираща 11 mM глюкоза самостоятелно или 25 mM KCl при 2.8 mM глюкоза. След инкубация при 37 ° С в 5% CO2 в продължение на 30 минути, супернатантите се измерват за освобождаване на инсулин, както е описано по-горе.

Имуномаркиране

Панкреатите се дисектират и фиксират за една нощ в 4% параформалдехид при 4 ° С и се поставят в 30% разтвор на захароза за една нощ при 4 ° С. Панкреатите бяха вградени в O.C.T. (Tissue-Tek) и сериен разрез на криостат при 10 mM. Индиректна локализация на протеини се получава чрез инкубации с първични антитела за една нощ при 4 ° С. Секции бяха оцветени с помощта на морски свинчета анти-инсулин (1: 200; Dako, СА, САЩ), плъх анти-мишка F4/80, плъх анти-мишка CD68 (1: 200; Bio-Rad, СА, САЩ), заек анти -IBA-1 (1: 200; Wako, VA, САЩ), козя анти-мишка CD31 (R&D Systems, MN, USA), заешка анти-мишка Ki67 (abcam, MA, USA) и вторично анти-тяло, конюгирано с Alexafluor 488, 568 и 647 (1: 400). Процентът на CD68 + и F4/80 + клетки се определя чрез преброяване на положителни клетки/общо клетки в отделния остров. Изображенията и количественото определяне бяха извършени с помощта на Zeiss LSM 800 с конфокален микроскоп за сканиране airyscan (Zeiss, Thornwood, NY 10594, САЩ), контролиран със софтуер за анализ на изображения ZEN Blue и изображение J.

Проточна цитометрия

16-месечни постни и db/db малки оръжия бяха жертвани и панкреасните островчета бяха изолирани. Накратко, островчета бяха изолирани от панкреаса на мишки донори чрез разграждане на колагеназа (0,8 mg/ml) (Sigma-Aldrich), последвано от ръчно бране. Островчетата се измиват с островна среда, състояща се от: среда RPMI-1640, допълнена с 1% (об./Об.) L-глутамин, 1% (об./Об.) Пеницилин - стрептомицин, 11 mmol/l глюкоза и 10% ( об./об.) FCS. След това островчетата бяха дисоциирани в единични клетки чрез разграждане на Accutase® (Thermo Fisher Scientific, МА, САЩ). След това бяха проведени анализи на имунооцветяване и поточна цитометрия съгласно стандартните процедури. Използвани са следните антитела: PE-Cy7-маркиран CD45, APC-Cy7-маркиран CD11b, PE-маркиран F4/80, BV421-маркиран MHC II и BV605-маркиран Ly6C (Biolegend, Сан Диего, Калифорния). Клетките бяха предварително обработени с Fc блок (клон 2.4G2). Едноклетъчни суспензии на ензимно дисоциирани панкреатични островчета се оцветяват в продължение на 30 минути върху лед и впоследствие се анализират на поточен цитометър Fortessa X-20 (BD Biosciences, Калифорния, САЩ).

Анализ на цитокини/хемокини ex vivo

Мишките островчета бяха изолирани, както е описано по-горе. Изолирани островчета (≈100) се култивират в продължение на една нощ в среда CMRL-1066, съдържаща 10% FCS, 2 mmol/L L-глутамин, 100 единици/ml пеницилин и 0,1 mg/ml стрептомицин (пълен CMRL). Цитокини/хемокини в супернатанта на култура на миши остров бяха открити, като се използва Milliplex® MAP Mouse Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, супернатантата се нанася върху 96-ямкови плаки. След инкубиране през нощта с магнитни топчета, пробите се измиват и инкубират при стайна температура с детектиращи антитела. Проби бяха открити след добавяне на стрептавидин-фикоеритрин върху Bio-Plex 200 и анализиран софтуер Bio-Plex manager ™ (Bio-Rad, Калифорния). Препаратите за човешки островчета, използвани в нашето проучване, са в съответствие с етичното одобрение (NTU Singapore, # IRB-2018-05-052) и с разпоредбите за докладване, както е описано по-горе (53). HP-006, HP-007 и HP-18330-01 са уникални идентификатори на човешки островчета, изолирани съответно от жени на възраст 46, 58 и 53 години и без анамнеза за диабет (HbA1c * Водещ автор

Авторите заявяват, че не съществува конфликт на интереси.