1 Център за клетъчни и молекулярни изследвания, Университет по медицински науки в Кюрдистан, Санандаж, Иран

ureaplasma

2 Микробиологичен отдел, Медицински факултет, Университет по медицински науки в Кюрдистан, Санандадж, Иран

3 Студентски комитет за изследвания, Университет по медицински науки в Кюрдистан, Санандадж, Иран

* Автор-кореспондент: Рашид Рамазанзаде
Университет по медицински науки в Кюрдистан,
Санандаж, Иран.
Тел: +989143104424
Електронна поща: [имейл защитен]

Дата на получаване: 22 април 2018 г .; Приета дата: 11 май 2018 г .; Дата на публикуване: 16 май 2018 г.

Цитат: Rashid R, Safari A (2018) Откриване на резистентност към хинолони в клинични изолати на Ureaplasma urealyticum. Arch Clin Microbiol. Vol.9 No.3: 82. doi: 10.4172/1989-8436.100082

Резюме

Заден план: Широкото използване на хинолони повишава резистентността към тези антибиотици в Ureaplasma urealyticum. Хинолоновата резистентност се появява в U. urealyticum поради Point мутации в ДНК топоизомераза и ДНК гиразни гени (gyrA, gyrB, parC и parE). Целта на това проучване беше определяне на точкова мутация в клиничен изолат чрез PCR и методи за секвениране.

Материали и методи: За да се изследва разпространението на мутации на резистентност към хинолон, бяха събрани положителни проби от 30 U. urealyticum от бременни жени, насочени към акушерско-гинекологичния отдел или пренаталната клиника в болница Beasat, Sanandaj, Иран. Извършена е екстракция на ДНК. Точковата мутация на целевите гени се извършва след реакция на PCR амплификация чрез секвениране.

Резултати: Резултатите от генното секвениране показват, че заместването на аминокиселини в кодон 83 parC се е случило в 5 проби. Аспарагинова киселина 82 Промяната на аспарагина, причинена от заместване на аминокиселини D до N, се е случила в 4 случая. Резултатите от gyrA генното секвениране показват, че аминокиселинното заместване в кодон 104 се е случило в 2 проби. Промяната на заместване на аминокиселина в GUL104LYS се наблюдава при 5 проби.

Заключение: Хинолоните са най-често срещаните антибиотици, ефективни при лечение на инфекции, причинени от U. urealyticum. Следователно ранното откриване на резистентни гени е от съществено значение за коригиране на режима на лечение, за да се предотврати разпространението на резистентни щамове.

Ключови думи

U. urealyticum; Хинолони; gyrA; gyrB; parC; parE

Въведение

Ureaplasma spp. са един от патогените, предавани по полов път, които считат, че етиологичен агент на уретрит, простатит, бактериална вагиноза, цервицит и таз може да доведе до безплодие при мъжете и жените [1-4]. За лечение на инфекции, причинени от тази бактерия, флуорохинолоните са най-използваните антибиотици. Този антибиотик убива уреаплазмата чрез инхибиране на репликацията на ДНК. В днешно време има все повече доклади за придобита резистентност към хинолони [5]. Механизмът на резистентност към флуорохинолон в уреаплазмата зависи от точкови мутации в ДНК-гираза и топоизомераза IV [4-7].

За да се разбере степента на резистентност на U. urealyticum, е необходимо да се анализират скоростите на мутация. Следователно, ние определихме скоростта на мутация на U. urealyticum към хинолонови антибиотици, използвайки PCR и секвениране на GyrA и GyrB субединици на ДНК гираза и ParC, ParE субединици на топоизомераза IV в клинични изолати.

Материали и методи

Бактериални изолати

Това проучване е направено на проба, описана по-рано [2]. Взети са проби от бременни жени, насочени към акушерско-гинекологичния отдел или пренаталната клиника в болница Beasat, Санандаж, Иран. За всички жени ендоцервикалните проби бяха събрани с помощта на памучен суап в стерилни 15-милилитрови соколи, съдържащи 5 ml фосфатно буфериран физиологичен разтвор и поставени при 70 ° C до екстракция на ДНК.

ДНК екстракция

Пробите бяха прехвърлени в лаборатория в стандартно състояние. ДНК екстракцията се извършва по инструкция на Kit (High pure PCR Template Preparation; Roche, Германия). Екстрахираната ДНК се разклаща при -70 ° С до PCR тест.

PCR тест

PCR се извършва в краен обем от 20 ml за ParC и parE и gyrA гени с праймери, както е показано в маса 1.

5´ до 3´ последователности праймери ген
TTGATGGTGATAGTGCAG gyrA-F gyrA
TAGTAAGTCAGTGTGGGT gyrA-R
CCCGTTCAACGACGTATTTT ParC-F парС
TCTGTATAACGCATCGCAGC ParC-R
TCGCAAACGTCCTGGAATGT ParE-F parE
AGCGTTTTCATGCACACCAC ParE-R

Маса 1: Праймерите бяха за PCR амплификации в клинични проби.

PCR се извършват в термоциклер (Eppendorf, Хамбург, Германия) с програма, включваща: първоначална денатурация 94 ° C за 10 минути, последвана от 30 цикъла на денатурация при 94 ° C за 1 минута, отгряване при 64 ° C за 30 секунди, и удължаване при 72 ° C за 1 минута и окончателно удължаване при 72 ° C за 10 минути. За да се наблюдават амплифицираните PCR продукти, гел електрофорезата се извършва в 1,5% гел агароза, оцветена с етидиев бромид, и след това се снима след визуализиране с UV светлина.

Последователност

PCR продуктите бяха изпратени на Sina Clone co за секвениране. Резултатите от секвенирането бяха анализирани с помощта на софтуера Chromas pro V 2.1.1. Използвайки онлайн софтуер, включително FASTA и Европейския институт по биоинформатика (EMBL-EBI), данните бяха подравнени и открита точкова мутация.

Резултат

Проведеното проучване за изследване на разпространението на мутации на хинолонова резистентност в 30 проби за гени parC, parE и gyrA, както е показано в Таблица 2. Резултатите от генното секвениране показват, че се е случило заместването на аминокиселини в кодон 83 parC. Заместване на аминокиселина Ser83luc, причинено от движение S към L в 5 проби. Аспарагинова киселина 82 Промяната на аспарагина, причинена от заместване на аминокиселини D до N, се е случила в 4 случая. Резултатите от gyrA генното секвениране показват, че аминокиселинното заместване в кодон 104 се е случило в 2 проби. Промяната на заместване на аминокиселина в GUL104LYS се наблюдава при 5 проби.

Мутация
Гени Не Да Обща сума
GyrA 28 (93%) 2 (7%) 30
ParC 24 (40%) 6 (60%) 30
Par E 24 (40%) 6 (60%) 30

Таблица 2: Точковите мутации водят до изследвани проби чрез секвениране.

Дискусия

Много патогенни бактерии, които заразяват гениталния тракт на жените, включително генитални микоплазми, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Enterobacteriaceae, Грам-положителни коки и Gardenella vaginalis. Семействата на микоплазмите могат да причинят хронични и субклинични генитални инфекции, които могат да имат отрицателно въздействие върху плодовитостта на жените [1,8-10]. Уреаплазмата е една от основните причини за негонококов уретрит (NGU) при мъжете, също и при бременни и небременни жени, причинявайки преждевременно раждане, спонтанен аборт, преждевременно раждане, вагинит и цервицит. Днес резистентността към лекарства е основен проблем в повечето страни. Тази резистентност непрекъснато се увеличава поради ограничения брой ефективни лекарства, а също така е заплаха в контролната програма [5,11-15].

ДНК топоизомераза IV има две субединици, кодирани от parC и parE гени. Заместването на аминокиселини като D82N, S83l и E87L в parC гена причинява резистентност към хинолони. Съществуват и други мутации в гена parC аминокиселина аспарагин на аспарагинова киселина е заместен в зона 82 и зона 87 е глутаминова киселина на левцин [16-19]. В нашето проучване честотата на мутация в резистентния ген parC е била 20%.

Kawai през 2015 г. в проучване U. urealyticum, от 158 изолати, 23,4% резистентност към хинолон при мутация на parC ген, което води до промени в гена, откри специфична област, наречена s83l [7]. генът parE е необходим за разделяне на бактериалната хромозома. Аминокиселинната последователност, кодирана от гена parE и parC, има много прилики. Мутациите в С-крайните аминокиселини, кодирани от този ген, предизвикват резистентност към хинолони. Резистентност към хинолон в U. urealyticum може да възникне поради заместване на аминокиселини в ASP435 на Asn.

ДНК-гираза, кодирана от gyrA и gyrB гени. Замяната на аминокиселини Q104K в гена gyrA причинява резистентност към хинолони. В gyrA ген в позиция 104 лизинът се заменя с глутамин [7,13,16,19-21]. В нашето проучване степента на мутация в резистентния ген gyrA е 6,6%.

Заключение

Хинолоните са най-често срещаните антибиотици, ефективни при лечение на инфекции, причинени от U. urealyticum. Следователно ранното откриване на резистентни гени е от съществено значение за коригиране на режима на лечение, за да се предотврати разпространението на резистентни щамове. Изследването също ни показа мутация на parC ген в позиция 82 и в позиция 104 на gyrA ген като маркер за устойчивост към хинолони в изолиран U. urealyticum.

Списък на съкращенията

Ureaplasma urealyticum (U. Urealyticum), гени на ДНК-гираза (gyrA, gyrB, parC и parE).

Наличност на данни и материали

Всички данни, генерирани или анализирани по време на това проучване, са включени в тази публикувана статия.

Конкуриращи се интереси

Авторите заявяват, че няма конфликт на интереси по отношение на публикуването на тази статия.

Финансиране

Това проучване се финансира от Университета по медицински науки в Кюрдистан. Финансиращият орган управлява предложението за преглед на това проучване и те не играят никаква роля в събирането на данни, анализа и интерпретацията на данните и в написването на този ръкопис.

Принос на авторите

Amir Safari извърши проучването и събра данни. Рашид Рамазанзаде ръководи проучването, участва в проектирането и провеждането му и подготвя оригиналната версия на ръкописа. Всички автори проучиха и одобриха съдържанието на настоящия ръкопис и участваха в преразглеждането на статията.

Признание

Това е част от тезата на Amir Safari (магистър по медицинска микробиология). Авторите искат да изразят своята благодарност към заместник-изследователя на Университета по медицински науки в Кюрдистан за финансовата подкрепа.