Допринесе еднакво за тази работа със: Шуншун Джу, Же Тиан

мастна

Концептуализация на ролите, куриране на данни, официален анализ, разследване, методология, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отделение по молекулярна генетика, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония

Допринесе еднакво за тази работа със: Шуншун Джу, Же Тиан

Концептуализация на ролите, куриране на данни, официален анализ, разследване, методология, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отделение по молекулярна генетика, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония

Отдел за принадлежност към лабораторни животински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония

Разследване на ролите, методология

Отделение по спешна хирургия, Първа свързана болница на Харбинския медицински университет, Харбин, Китай

Отделение по молекулярна генетика, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония

Отдел по молекулярна генетика, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония, Катедра по имунология, алергия и съдова биология, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония

Отдел по молекулярна генетика, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония, Център за метаболитно регулиране на здравословното стареене (CMHA), Кумамото университет, Кумамото, Япония

Отделение за молекулярна генетика, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония, Отдел на клиниката за мишки Кумамото, Институт за развитие и анализ на ресурсите (IRDA), Университет Кумамото, Кумамото, Япония

Отдел по молекулярна генетика, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония, Център за метаболитно регулиране на здравословното стареене (CMHA), Университет Кумамото, Кумамото, Япония

Отдел по молекулярна генетика, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония, Център за метаболитно регулиране на здравословното стареене (CMHA), Университет Кумамото, Кумамото, Япония

Отдел по молекулярна генетика, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония, Катедра по имунология, алергия и съдова биология, Висше училище по медицински науки, Кумамото университет, Кумамото, Япония, Център за метаболитно регулиране на здравословното стареене ( CMHA), Университет Кумамото, Кумамото, Япония

Придобиване на финансиране на роли, надзор, писане - преглед и редактиране

Отдел по молекулярна генетика, Висше училище по медицински науки, Университет Кумамото, Кумамото, Япония, Център за метаболитно регулиране на здравословното стареене (CMHA), Университет Кумамото, Кумамото, Япония

  • Шуншун Джу,
  • Же Тиан,
  • Daisuke Torigoe,
  • Джиабин Жао,
  • Пейю Сие,
  • Taichi Sugizaki,
  • Мичио Сато,
  • Харуки Хоригучи,
  • Казутойо Терада,
  • Цуйоши Кадомацу

Фигури

Резюме

Цитат: Zhu S, Tian Z, Torigoe D, Zhao J, Xie P, Sugizaki T, et al. (2019) Перимускулната мастна тъкан, свързана със стареенето и затлъстяването, ускорява мускулната атрофия. PLoS ONE 14 (8): e0221366. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0221366

Редактор: Ашок Кумар, Университет в Хюстън, САЩ

Получено: 10 май 2019 г .; Прието: 5 август 2019 г .; Публикувано: 23 август 2019 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Японското общество за насърчаване на науката, Grant 17H05652 (за YO), Програмата за основни изследвания за еволюционна наука и технологии (CREST) ​​на Японската агенция за наука и технологии (JST) 13417915 (за YO), Програмата CREST на Японската агенция за медицински изследвания и развитие (AMED) Безвъзмездна помощ 18gm0610007 (на YO) и от Проекта за изясняване и контрол на механизмите за стареене и дълголетие от AMED Grant 17gm5010002 (на YO). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Саркопенията, която се характеризира като загуба на скелетна мускулна маса и сила, наблюдавана при по-възрастни индивиди, привлича вниманието като основна причина за намалено качество на живот (QOL) поради физическо бездействие [1, 2]. Броят на хората със саркопения бързо се увеличава, тъй като броят на възрастните хора се увеличава по целия свят [3, 4]. Някои пациенти със саркопения са с наднормено тегло и проявяват тежко физическо бездействие, патология, наречена саркопенично затлъстяване (SOB) [5, 6]. Как затлъстяването и/или стареенето предизвиква мускулна атрофия не е напълно определено.

При патологията на свързаните със затлъстяването заболявания, ектопичното натрупване на липиди в неадипозна тъкан, като черен дроб или сърдечно-съдовата система, ускорява развитието на състояния като неалкохолен стеатохепатит и атеросклеротично сърдечно-съдово заболяване [7–9], което предполага, че натрупването на липиди функции в прогресията на заболяването. Неотдавнашен доклад докладва, че мастната тъкан се натрупва в пространството около скелетните мускули като околомускулна мастна тъкан (PMAT) при някои пациенти в напреднала възраст или със затлъстяване (10). В това проучване съотношението между мастната и мускулната тъкан в крака, изчислено чрез ултразвуково интензитет на ехото, е обратно свързано с дебелината на мускулите при възрастни индивиди [10], което предполага, че при стареенето или затлъстяването натрупването на маточна маст е положително корелирано с мускулна атрофия и последващо развитие на саркопения.

Тук, използвайки възрастни и затлъстели мишки, ние показваме, че PMAT, разглеждан като натрупване на извънматочна мастна тъкан, заобикаляща скелетните мускули, се увеличава паралелно с мускулната атрофия поради намаления размер на клетките от миофибър тип II. RT-PCR анализите разкриват сравними модели на експресия на гени, свързани със секретирани фактори при стареене и затлъстяване на мастната тъкан, което предполага общ ефект на PMAT върху мускулната атрофия. Когато попитахме как PMAT влияе на мускулната атрофия при мишки, открихме, че степента на денервация, индуцирана мускулна атрофия при мишки, трансплантирани със затлъстела мастна тъкан, е по-голяма от тази, наблюдавана при мишки, които са трансплантирани с незатлъстела мастна тъкан. Забележително е затлъстяването на мастна тъкан, трансплантирано in vivo активирани транскрипционни фактори FoxO и повишена експресия на гени, свързани с медиирана от убиквитин протеолиза и клетъчно стареене в мускулите. Обратно, при затлъстели мишки, премахването на PMAT намалява индуцираната от денервация мускулна атрофия и потиска промени в експресията на гени, свързани с протеолиза и стареене в мускулите. Като цяло, това проучване показва, че отлагането на PMAT ускорява атрофията на мускулите, причинена от възрастта и затлъстяването, чрез активиране на FoxO фактори и техните цели, медииране на протеолиза и стареене в мускулите и насърчаване на развитието на саркопения.

Материали и методи

Изследвания върху животни

В това проучване са използвани мъжки мишки от див тип (C57BL/6) и db/db (с контролни + m/+ мишки) мъжки мишки (CLEA Japan Inc., Токио, Япония). Всички мишки бяха държани в съоръжение без патогени (в Центъра за животински ресурси и развитие, Университет Кумамото, Кумамото, Япония) при контролирани условия на околната среда с 12:12 часа светлина: тъмен цикъл при стабилна температура от 23 ° C и хранена вода и нормална диета (ND) (CE-2; CLEA Japan Inc., Токио, Япония) ad libitum.

Млади и възрастни мишки са хранени с ND и се оценяват отделно от 3-6 месеца и 18-22 месеца. Затлъстелите мишки са установени чрез хранене с високо съдържание на мазнини (HFD-32; CLEA Japan Inc., Токио, Япония) в продължение на 12 или 24 седмици, започвайки от 8-седмична възраст. Контролните мишки бяха хранени с нормален чау (ND) (CE-2; CLEA Japan Inc., Токио, Япония) в продължение на 12 или 24 седмици. Подходящи за db/db мишки, 8-седмични db/db мъжки мишки и съответните + m/+ m контролни мишки бяха хранени с ND. Експериментите с животни бяха одобрени от Комитета за преглед на етиката на университета Кумамото.

Модел на денервация на мишка и хирургия на трансплантация на мастна тъкан

Установен е модел на мускулна атрофия, предизвикан от денервация на мишката, както беше съобщено по-рано [11]. Накратко, десетседмични мъжки мишки C57BL/6 бяха анестезирани с пентобарбитал чрез интраперитонеално инжектиране и резекция на седалищния нерв на десния долен крайник. За проучвания за трансплантация, използващи ингвинална бяла мастна тъкан (iWAT) от HFD или ND-хранени мишки, беше направен разрез на повърхността на гастрокнемийния мускул на десния крак и 20 mg ингвинална мастна тъкан от ND- или HFD-хранени мишките бяха трансплантирани в пространството около мускулите на гастрокнемия. Когато използвахме iWAT от db/db мишки като затлъстела мастна тъкан, следвахме идентичния протокол, но трансплантирахме 20 mg ингвинална мастна тъкан от мишки + m/+ m или мишки db/db. Две седмици по-късно мишките бяха умъртвени за анализ.

Компютърна томография (CT)

Мишките бяха анестезирани чрез интраперитонеално инжектиране на пентобарбитал, а мускулите на гастрокнемия и околните мазнини бяха оценени чрез рентгеново затихване в изображения на компютърна томография (CT) (La Theta; Aloka Ltd., Токио, Япония).

Непряка калориметрия

Ежедневните дейности на мишките и нивата на потребление на O2 (VO2, L/min) и производството на CO2 (VCO2, L/min) се измерват с помощта на система за индиректна калориметрия (MK-5000RQ, Muromachi Kikai Co., Ltd., Токио, Япония). VO2 и VCO2 бяха използвани за изчисляване на EE (kcal/ден), използвайки уравнението на Weir, в което EE = [(VO2 × 3.941) + (VCO2 × 1.11)] × 1.44, както беше съобщено по-рано [12].

C2C12 култура и лечение на миотръби

C2C12 клетки се култивират, както е описано другаде [11]. Накратко, клетките C2C12 бяха отгледани в среда за растеж, съдържаща модифицирана среда на Eagle на Dulbecco (DMEM; WAKO 044–29765, Токио, Япония), допълнена с 10% фетален говежди серум, 100 U/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин в 5% CO2 овлажнена атмосфера при 37 ° C. Когато клетките достигнат 60–80% сливане, средата се заменя с диференцираща среда, съставена от DMEM, съдържаща антибиотици и 2% конски серум, обикновено

96 часа след засяването. Средата се сменяше на всеки 48 часа. 24 часа по-късно, когато потвърдихме сливането на миоцитите, за да оценим ефектите от PAI-1 върху атрофията на миотръбите, добавихме 100 nM дексаметазон (DEX; Sigma-Aldrich D1756-25MG, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) в превозно средство със или без 5 μg/ml PAI-1 (ab93068, Abcam, Кеймбридж, Великобритания) към култури на миотръби, както е съобщено другаде [13].

Процедури за оцветяване

Пробите от мускули на гастрокнемиус се дисектират и фиксират в изопентан в течен азот и се нарязват на 8 μm секции. Оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E; Wako, Осака, Япония) беше извършено за оценка на основната мускулна морфология. Площта на напречното сечение беше анализирана с помощта на софтуер за анализатор BZ-X (Keyence, Осака, Япония).

За да се оцени натрупването на мазнини в гастрокнемиус, беше извършено оцветяване с Oil Red O (Sigma-Aldrich Co. LLC, САЩ) съгласно нашия предварително публикуван протокол [14]. Оцветените проби върху слайд очила са изобразени с помощта на микроскоп (модел BZ-9000; Keyence, Осака, Япония).

Оцветяването с АТФаза се извършва, както е съобщено другаде [15]. Накратко, първо смесихме 8 ml 0,1 M натриев барбитал (Nakalai Tesque, Киото, Япония) и 8 ml 0,18 M CaCl2 (WAKO, Токио, Япония) с 24 ml дейонизирана вода до крайно рН 10,3 (смес 1). След това смесихме 8 ml 0,1 М натриев барбитал, 4 ml 0,18 M CaCl2 и 100 mg ATP динатриева сол (Kohjin Co., Ltd., Токио, Япония) с 24 ml дейонизирана вода до крайно рН 9,4 (смес 2). Проби от секции се разклащат в смес 1 в продължение на 15 минути и след това се прехвърлят в смес 2 и се разклащат още 45 минути. След това пробите се изплакват в 1% CaCl2 3 пъти в продължение на 10 минути и се третират с 2% разтвор на CoCl2 (Nakalai Tesque, Киото, Япония) в продължение на 3 минути с разклащане. Пробите се изплакват с 0,01 М натриев барбитал 8 пъти и след това с дейонизирана вода за 3 минути. След това добавихме 1% обем/обем разтвор на амониев сулфид (Kanto Chemical Co., Inc., Токио, Япония) (1 ml запас NH4SO2 + 99 ml D.I.H2O) към оцветяващия буркан за 1 min. Накрая пробите бяха изплакнати, дехидратирани и монтирани с капаци.

Количествена PCR в реално време

Общата РНК беше извлечена с помощта на TRIzol реагент съгласно нашия предишен протокол [14]. Накратко, 1,5 μg обща РНК се използва за синтез на първа верига с обратна транскриптаза на cDNA и произволни праймери. Обработената с DNase РНК се транскрибира обратно, като се използва Reagent Kit Prime Script (Takara Bio Inc, Shiga, Япония). Относителното изобилие на транскрипти се нормализира до това на нивата на 18S рРНК при мишки. Последователностите на набора от грундове са показани в таблица S1.

Уестърн блотинг

Уестърн блотинг се извършва, както е описано другаде [15]. Накратко, 10 μg цитоплазмен или ядрен протеин се разделят на SDS-PAGE и се прехвърлят в PVDF мембрани. Мембраните с ядрен протеин бяха инкубирани с анти-FoxO3a (# 12829) или анти-FoxO1 (# 2880). Мембраните с цитоплазмен протеин бяха инкубирани с анти-p-FoxO3a (# 2599), анти-p-FoxO1 (Ser256) (# 9461), анти-p-AKT (Ser473) (# 9271), анти-p-AKT (Thr308 ) (# 4056) или анти-AKT (# 9272; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) антитела при 4 ° C за една нощ, разредени 1: 1000 в разтвор 1 (TOYOBO, Co., Ltd., Osaka, Japan). След измиване с TBST, мембраните се инкубират с конюгиран с HRP овчи анти-заешки IgG (GE Healthcare Life Science, Piscataway, NJ, USA), разреден 1: 2000 в разтвор 2 при стайна температура за 60 минути. Вътрешните контроли бяха миши анти-Hsc70 (sc-7298; Санта Круз Биотехнология, Санта Круз, Калифорния, САЩ) за цитоплазматичен имуноблотинг и миши антихистон Н3 (# 4499) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) за ядрен имуноблотинг . Hsc70 и Histone H3 бяха използвани за нормализиране.

статистически анализи

Резултатите се отчитат като средна стойност ± стандартна грешка (SEM). Статистическите разлики между две групи бяха определени с помощта на несдвоения двустранен t-тест на Student. Счита се, че статистическата значимост е p Фиг. 1. Отлагането на PMAT е положително корелирано със саркопения.

(A) Телесно тегло (BW), мускулно тегло (MW) и съотношение MW/BW при млади и възрастни мишки. (B) Представителни CT изображения (леви панели) и съотношението на мазнините въз основа на CT анализ (десен панел) в долните крайници на млади и възрастни мишки. (C) Представително оцветяване с НЕ (леви панели), количествено разпределение (среден панел) и средна площ на напречното сечение на мускулните влакна (CSA) (десен панел) в долните крайници на млади и възрастни мишки. (D) Представително оцветяване с АТФаза (леви панели), разпределение на CSA на мускулни влакна от тип II (среден панел) и средно ниво на CSA от тип I (бели клетки в левия панел) и мускулни влакна от тип II (черни клетки в левия панел) в долните крайници при млади и възрастни мишки (десен панел) (n = 50–100, тип I; n = 1200–1500, тип II). (E, F) Относителни нива на транскрипти, маркиращи подтипове на миозиновите скелетни мускули (Myh7, Myh2, Myh1 и Myh4) (E), клетъчно стареене (p16, p19, p21 и p57) и разграждане на протеини (Atrogin1 и Murf1) (F) в gastrocnemius на млади и възрастни мишки. Нивата на транскрипт се нормализират до 18s иРНК; стойностите при млади мишки бяха определени на 1. Младите мишки бяха на възраст 3-6 месеца, а на възраст мишки на възраст 18-22 месеца. (Мащабна лента: 100μm в c, d). (n = 6-8 на група в a, e, f). Всички данни са представени като средни стойности ± S.E. Статистическата значимост се определя чрез t-тест на Student. *, p Фигура 2. Възрастните мишки проявяват PMAT се увеличава с влошена саркопения.

(A) Представителни CT изображения (леви панели) и изчислено съотношение на мазнини в долните крайници (десен панел) при възрастни мишки с по-малко от (Фиг. 3. PMAT нараства при затлъстели мишки и е придружено от ускорена атрофия на скелетните мускули.